ICS 65.020.01 CCS B 21 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3170—2023 籽用西葫芦种子病毒 RT-PCR检测技术规程 Technical code of practice for RT -PCR detection of seed -used pumpkin(Cucurbita pepo L.)seed virus 2023-09-15发布 2023-10-15实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3170 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（ SAM/TC 25 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学。 本文件主要起草人：王萍、刘杰才、陈贵华、许珂、尚鹏、李石恒、毕晓宇。 DB15/T 3170 —2023 1 籽用西葫芦种子病毒 RT-PCR检测技术 规程 1 范围 本文件规定了籽用西葫芦种子病毒 RT-PCR检测技术中涉及的试剂与材料、仪器和设备、对照设置、 样品采集、样品病毒检测、结果分析与表述。 本文件适用于籽用西葫芦种子中黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus ，CMV）、西瓜花叶病毒 （Watermelon mosaic virus ，WMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic virus ，ZYMV） 的RT-PCR检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 黄瓜花叶病毒 cucumber mosaic virus ，CMV 黄瓜花叶病毒 (CMV)属于雀麦花叶病毒科（ Bromoviridae ）黄瓜花叶病毒属（ Cucumovirus ），可以 侵染1000多种植物。主要通过蚜虫以口针型非持久方式传播，也是典型的种传病毒。黄瓜花叶病毒一般 为系统侵染植物，主要表现为叶片斑驳，叶肉浅绿，叶脉深绿；严重时呈现叶片皱缩，叶肉退化，蕨叶 等症状。 西瓜花叶病毒 watermelon mosaic virus, WMV 西瓜花叶病毒（ WMV）属于马铃薯 Y病毒科（ Potyviridae ）马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus ），在自然 界中通过蚜虫以非持久性方式传播，也可经汁液摩擦接种传播，可侵染葫芦科、豆科、藜科等多种植物 种类。受侵染的病株叶片表现花叶、畸形、新生叶片扭曲，植 株生长受阻，果实畸形。 小西葫芦黄化花叶病毒 zucchini yellow mosaic virus ，ZYMV 小西葫芦黄化花叶病毒 （ ZYMV） 属于马铃薯 Y病毒科（Potyviridae ） 马铃薯Y病毒属 （Potyvirus ）， 可由多种蚜虫以非持久性方式传播，也能通过种子传播。可侵染葫芦科、苋科、豆科等 11个属的植物。 小西葫芦黄化花叶病毒表现为系统侵染，整株花叶、黄化、叶片皱缩、果实畸形、表面有泡状或者瘤状 突起。 DB15/T 3170 —2023 2 4 试剂与材料 琼脂糖。 核酸染料。 10 mol/L 氢氧化钠 (NaOH)溶液：在 160 mL水中加入 80.0 g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再 加水定容至 200 mL。 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2)溶液(pH 8.0) ：称取186 g乙二胺四乙酸二钠，加入 70 mL水中， 缓慢滴加氢氧化钠溶液 (见4.3)直至EDTA-Na2完全溶解， 用氢氧化钠溶液 (见4.3)调pH至8.0 加水定容至 100 mL。在121 ℃条件下灭菌 20 min。 1 mol/I三羟甲基氨基甲烷 -盐酸(Tris-HCI)溶液(pH 8.0) ：称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷溶解 于800 mL水中，用盐酸调 pH至8.0加水定容至 1000 mL。在121 ℃条件下灭菌 20 min。 TE缓冲液(pH 8.0) ：分别量取 10 mL三羟甲基氨基甲烷 -盐酸溶液 (见4.5)和2 mL乙二胺四乙酸 二钠溶液 (见4.4)，加水定容至 1000 mL。在121 ℃条件下灭菌 20 min。 50×TAE缓冲液：称取 242.2 g三羟甲基氨基甲烷 (Tris)，先用500 mL水加热搅拌溶解后，加入 100 mL乙二胺四乙酸二钠溶液 (见4.4)，用冰乙酸调 pH至8.0，然后加水定容至 1000 mL。使用时用水 稀释成1×TAE。 加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加入 10 mL水，在室温下溶解 12 h；称取250.0 mg 二甲基 苯腈蓝，加 10 mL水溶解；称取 50.0 g蔗糖，加 30 mL水溶解。混合以上 3种溶液，加水定容至 100 mL，在4℃下保存。 DNA分子量标准：可以清楚区分 100 bp～500 bp的DNA片段。 Premix Taq 酶。 CMV病毒检测上游引物 CMV-F: 5´-TTCGATAAGAAGCTTGTTTC GCG-3´，下游引物 CMV-R: 5´- AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT -3´。预期扩增目的片段大小为 345 bp(参见附录 A中的A.1)。 WMV病 毒 检 测 上 游 引 物 WMV-F:5´-CCAGTGGCAAAGGTGATA -3´ ， 下 游 引 物 WMV-R:5´- TGCTGCGTCTGAGAAATG -3´。预期扩增目的片段大小为 485 bp(参见附录 A中的A.2)。 ZYMV病毒检测上游引物 ZYMV-F: 5´-ATGCAGAGGCACCATACAT -3´，下游引物 ZYMV-R: 5´- TACTGCATTGTGTTCACACC -3´。预期扩增目的片段大小为 283 bp(参见附录 A中的A.3)。 引物溶液：用 TE缓冲液（见 4.6）将上述引物稀释到 10 μmol/L。 TRIzol试剂。 TransScript One -Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒。 PCR产物回收试剂盒。 pMD18-T载体。 大肠杆菌感受态细胞 DH5a。 5 仪器和设备 分析天平。 组织研磨仪。 PCR扩增仪。 电泳槽、电泳仪 等电泳装置。 Nanodrop 微量分光光度计。 凝胶成像系统或照相系统。 DB15/T 3170 —2023 3 6 对照设置 阳性对照 以经过RT-PCR扩增和测序分析精确含有 CMV、WMV、ZYMV的样品为阳性对照。 阴性对照 经过RT-PCR扩增和测序分析精确不含有 CMV、WMV、ZYMV的样品为阴性对照。 空白对照 以灭菌ddH2O为空白对照。 7 样品采集 采集适量的籽用西葫芦种子，放入自封袋中封口后及时进行分析。如需保存可置于 -80℃冰箱中。 样品应避免交叉污染。 8 样品病毒检测 RNA提取和纯度检测 8.1.1 每个对照和试样设置 2次重复。 8.1.2 RNA提取：选取感染病毒的籽用西葫芦种子 50粒，冷冻研磨至粉状后，称取 0.1 g待测样品置 于灭菌2 mL离心管中，加入 1 mL TRIzol 试剂后混匀，提取籽用西葫芦种子总 RNA。 8.1.3 RNA浓度检测： 提取的样品总 RNA用Nanodrop 微量分光光度计测定 RNA相对浓度， 当 OD260/OD280 比值为1.8～2.0时，可用于 RT-PCR检测。 8.1.4 RNA质量检测：称量 1 g琼脂糖加入到 100 mL 1 ×TAE缓冲液中，加热混匀。冷却后加入 2 μ L核酸染料，混匀，将其倒入电泳槽，插上梳板。室温下凝固成凝胶后，倒入 1×TAE缓冲液中，垂直向 上轻轻拔去梳板。取 2 μL RNA与4 μL加样缓冲液混合后，加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔 加入DNA分子量标准，进行电泳检测。电泳结束后，观察结果（参见附录 B.1）。如果总 RNA条带清楚， 就可以用于后续实验。 反转录 8.2.1 每个对照和试样设置 2次重复。 8.2.2 以总RNA为模板， 进行反转录合成第一链 cDNA。 在离心管中加入 1 μg RNA模板，1 μL Anchored Oligo（dT）18引物和RNase-Free ddH 2O，混匀， 65 ℃孵育5 min，冰浴2 min。然后加入 10 μL 2× TS 反应液， 1 μL 反转录酶和 1 μL gDNA Remover ，轻轻混匀， 42 ℃孵育30 min。85 ℃加热5 sec 终止反应， -20 ℃冰箱保存备用。 PCR扩增 8.3.1 每个对照和试样 PCR扩增设置 2次重复。 8.3.2 按表1依次加入反应试剂，混匀，分装到 PCR管中。 DB15/T 3170 —2023 4 表1 PCR扩增体系 试剂 体积 Premix Taq 25μL cDNA 2μL 10μmol/L上游引物 1μL 10μmol/L下游引物 1μL ddH2O 补足50μL 8.3