(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210658622.8 (22)申请日 2022.06.11 (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨 浦区邯郸路2 20号 (72)发明人 任煜轩　孔慈航　李博　 (74)专利代理 机构 上海正旦专利代理有限公司 31200 专利代理师 陆飞　陆尤 (51)Int.Cl. G01N 21/65(2006.01) G01N 21/84(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种结合 光镊的受激拉曼显微成像装置 (57)摘要 本发明属于单细胞化学成像技术领域， 具体 为一种结合光镊的受激 拉曼显微成像装置。 本发 明装置包括激光光镊光路、 拉曼成像光路以及显 微镜等； 光镊光路将激光通过二向色镜耦合到显 微镜物镜实现强聚焦而形成强的梯度力光阱； 拉 曼光路包含时域同步、 空间重合的两路脉冲光， 两路脉冲激光经扫描振镜扫描后由光路系统耦 合到显微镜实现光束在样品上的二维扫描； 光镊 采用位置敏感探测器实现细胞等样品位置的实 时记录， 拉曼成像采用光电倍增管或光电探测器 经锁相放大后输出。 共定位的拉曼光源通过扫描 可实现样品多种组分的化学成像。 所发明的装置 可用来对细胞中多种化学成分进行拉曼共定位 成像， 在细胞组分分析和组分分布测量等领域具 有重要的应用。 权利要求书3页 说明书7页 附图3页 CN 115078326 A 2022.09.20 CN 115078326 A 1.一种结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 包括激光光镊部分、 拉曼显微 镜部分以及两者的耦合； 用于做受激 拉曼成像， 或者做相干反斯托克斯成像， 或者同时做两 种模式的成像； 其中： 所述激光光镊部分， 包括依次光路连接的光镊激光、 显微镜物镜、 微流道样品池、 搜集 物镜、 成像管镜、 位置敏感探测器以及必 要的透镜和反射镜； 由高数值孔径的显微镜物镜将 激光束聚焦到衍射极限大小， 具体为200 ‑500 nm； 在光斑附近的微米/纳米粒子因光强梯度 力的作用被吸引到光镊中； 所述光镊采用近红外激光对细胞等生物粒子进行无接触、 无损伤捕获， 并对细胞进行 无接触的固定， 为细胞实现较长时间扫描成像提供 稳定的位置固定； 所述拉曼显微镜部分， 包括依次光路连接的两个脉冲激光、 扫描转镜、 扫描透镜、 成像 透镜、 显微镜物镜、 搜集透镜、 成像管镜、 滤波片、 光电倍增管以及锁相放大器； 两个脉冲激 光在时域上以及空间上同步； 所述拉曼显微镜通过泵浦光和斯托克斯光与样品的相互作用实现共振拉曼成像 （SRS） 或者相干反斯托克斯 （CARS） 成像； 通过调节光电倍增管前的滤波片的透过率波段， 实现共 振拉曼成像和相干反斯托克斯成像的切换， 或者设计双通道分别实现受激拉曼成像和相干 反斯托克斯成像； 所述的激光光镊和拉曼成像的耦合， 采用双 色镜将光镊激光和拉曼激发光耦合到显微 镜系统； 再采用双色镜将光镊激光和拉曼信号光在空间上分开， 拉曼信号包括受激拉曼散 射或者相干反斯 托克斯散射 光。 2.根据权利要求1所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 所述的激光 光镊， 采用与拉曼显微镜激发光与发射光光谱不重叠的激光实现； 光镊的中心波长是比斯 托克斯谱线更长的波长， 或者比反斯托克斯谱线更短的波长， 或者是介于斯托克斯或反斯 托克斯谱线与拉曼激发光之间的任何波长 。 3.根据权利要求2所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 拉曼显微镜 部分中的扫描转镜、 扫描透镜、 成像透镜、 显微镜物镜组成扫描单元； 由扫描振镜对共轴的 拉曼泵浦光源和探测光进行二维角度扫描， 再经扫描透镜、 成像透镜、 显微镜物镜后， 对空 间上重合的两个光斑在样品上实现二维扫描； 由于泵浦光和探测 光在空间上重叠， 因而在 扫描过程中， 能够在样品空间上重叠； 同时在其中一条光路引出延迟调制单元， 确保两个脉 冲序列在样品上实现时间同步； 时间和空间的同时同步 为激发拉曼信号 提供可能； 所述的拉曼成像通过扫描单元对两个空间上重合的激光束进行扫描， 并经过激发样品 后由光电倍增管搜集到受激拉曼散射或相干反斯托克斯信号后， 再由计算机重构的二维图 像。 4.根据权利要求3所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 光镊部分和 拉曼显微镜分别设有各自的探测单 元； 光镊部分的位置敏感探测器作为探测单元， 并结合后焦面干涉法， 对光镊中捕获的粒 子的位置进行高精度的探测； 由于直接探测捕获激光的信号， 引入中性密度衰减片对激光 功率进行适当调整； 拉曼显微镜部分的以光电倍增管作为探测单元， 对拉曼信号进行探测； 由于拉曼信号 的强度比较弱， 需要 结合锁相放大器对信号进行放大； 为 实现锁相放大， 需要对拉曼激发光权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115078326 A 2的强度进行调制， 这里 的调制信号将做为锁相放大 的参考输入； 光电倍增管 的信号只有频 率与拉曼激发光调制频率 一致的信号被放大输出。 5.根据权利要求4所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 拉曼成像通 过光束扫描实现二 维受激拉曼图像的采集， 拉曼成像可针对细胞中特定成分， 包括脂质体、 水、 蛋白质， 进行 无标记、 多组分成像。 6.根据权利要求5所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 实验时， 无 标记的细胞通过微流道样品池流过激光光镊捕获区域； 当待测细胞被光镊捕获时， 位置敏 感探测器上记录细胞 的实时位置信号， 减小微流道里流体速度， 位置敏感探测器的信号涨 落逐渐趋于稳定； 光镊信号通过功 率谱密度进行标定； 再测量位置信号的均方差， 确保位置 信号均方差小于拉曼成像扫描步长的一半， 以减少像模糊； 再启用拉曼成像单元， 对待测细 胞进行扫描拉曼成像， 扫描区域大小根据待测细胞大小进行调节， 需要覆盖光镊捕获细胞 的区域。 7.根据权利要求1 ‑6之一所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 具体 包括： 第一激光器 （101） ， 延 迟和调制单元 （102） ， 第一双色镜 （103） ， 第二激光器 （104） ， 第一 反射镜 （105）， 二维扫描转镜 （106）， 扫描透镜 （107）， 第一成像管镜 （108）， 第三激光器 （109） ， 第二双色镜 （110） ， 显微镜物镜 （111） ， 微流道样品池 （112） ， 聚光镜 （113） ， 第二反射 镜 （114） ， 第二成像管镜 （115） ， 第三双色镜 （116） ， 滤色片 （117） ， 光电倍增管 （118） ， 位置敏 感探测器 （1 19） ， 锁相放大器 （120） ； 其中： 拉曼激光器 （101） 和 （104） 经第一双色镜 （103） 在空间重叠， 再由扫描振镜 （106） 对双光 束进行角度扫描； 经振镜二维角度扫描的这两个波长的激光经扫描透镜 （107） ， 成像管镜 （108） ， 和第一显微镜物镜 （1 11） 后， 转化为两光束在样品平面的二维扫描； 泵浦光与斯托克斯光的脉冲需要同时到达样品 同一位置， 因而在其中一路加上延迟单 元调节两个脉冲序列的时间延迟； 同时， 在其中一路使用一对反射镜调节两束光的相对位 置； 这里将强度调制和时间延迟单 元 （102） 集成在一 起， 使系统的结构紧凑； 其中， 对微米级介电粒子的操控采用单光镊实现， 对粒子位置的监测采用后焦面探测 实现； 受激 拉曼信号 或相干反斯托克斯 成像信号经光电倍增管 （ （118） ） 探测 后， 通过锁相放 大器120输出， 其中光强调制单 元 （102） 的调制信号 为锁相放大的参 考信号； 光镊光路自光源 （109） ， 经第二双色镜 （110） 耦合到主光路并经第一显微镜物镜 （111） 聚焦后形成激光光镊， 前向透过样品池的捕获激光经第二显微镜物镜 （113） 搜集后， 再经第 二反射镜 （114） 反射以及第二成像管镜 （115） ， 第三双色镜 （116） ， 进入位置敏感探测器 （119） ； 其中第二成像管镜 （115） 将第二显微镜物镜 （113） 的后焦面成像到位置敏感探测器 （119） 上。 8.根据权利要求7所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置， 其特征在于， 拉曼散射成 像根据需求， 使用飞秒或皮秒激光器激发； 飞秒激发使用光谱物理的超快激光器， 该激光器 能输出两个同步光束， 其中固定波长1045  nm， 可调谐波长范围为690 ‑1300nm， 120fs， 80MHz 重复频率， 两个同步的双光束输出能做受激拉曼散射成像和相 干反斯托克斯成像； 光镊激 光波长选为532 nm或者650 nm， 以与拉曼显微成像的激发和发射波长从光谱上错 开； 皮秒双色激光器采用绿光皮秒泵浦激光器与光学参量振荡器实现， 其中绿光泵浦的波 长为515 nm， 光学参量振荡器的调节波长为640至960nm； 为避免光镊激光波长与拉曼成像权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115078326 A 3