(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210605940.8 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 南京邮电大 学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区文苑路9 号 (72)发明人 宋春元　熊婧蓉　汪联辉　 (74)专利代理 机构 南京正联知识产权代理有限 公司 32243 专利代理师 姜梦翔 (51)Int.Cl. G01N 21/01(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 21/51(2006.01) G01N 21/65(2006.01) C12Q 1/68(2018.01)C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/115(2010.01) (54)发明名称 循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种循环肿瘤细胞 （CTCs） 的 比率式检测试剂盒及其制备方法和应用， 该比率 式检测试剂盒包括第一试剂Walker探针、 第二试 剂SERS探针、 第三试剂硫酸锌溶液。 所述试剂盒 用于CTCs检测时， 向含有待检测CTCs的样品中加 入第一试剂、 第二试剂和第三试剂， 磁性分离后 检测SERS光谱获取第二试剂SERS探针上拉曼分 子DTNB和第一试剂中ROX分子的SERS特征峰强度 的比值IR(IR=I1331/I1500)， 实现对CTCs的比率式 SERS定量检测。 本发明公开的比率式检测试剂盒 制备方法简单， 检测灵敏度与特异性高， 结果稳 定性好， 可满足血液中稀有CTCs可靠检测计数要 求， 具有突出的应用优势。 权利要求书2页 说明书8页 序列表1页 附图5页 CN 114942223 A 2022.08.26 CN 114942223 A 1.一种循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒， 其特征在于， 所述SERS检测试剂盒包括第 一试剂、 第二试剂和第三试剂； 所述第一试剂为Walker探针， 所述Walker探针是通过磁核金壳纳米颗粒表面修饰 walking核酸链、 含有酶切响应底物的发夹型核酸链H1、 巯基聚乙二醇甲氧基SH ‑PEG‑OMe制 备得到； 所述walking核酸链是由核酸适配体链SYL3C ‑ROX与Zn2+特异性DNAzyme链杂交而成 的； 所述第二试剂为SERS探针， 所述SERS探针是通过金纳米颗粒表面修饰发夹型核酸链H2 和拉曼信号分子 5,5’ ‑二硫代双(2 ‑硝基苯甲酸)制备 得到； 所述第三试剂为辅助DNAzyme 特异性切割底 物核酸链的硫酸锌溶 液。 2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂 盒， 其特征在于， 所述核酸适 配体链SYL3C ‑ROX、 Zn2+特异性DNAzyme链、 发夹型核酸链H1的碱基序列分别如 SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示。 3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂 盒， 其特征在于， 所述发夹型 核酸链H2的碱基序列如SEQ  ID NO.4所示。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂 盒， 其特征在于， 所 述磁核金壳纳米颗粒 粒径为10 0‑300 nm； 所述金纳米颗粒 粒径为15 ‑100 nm。 5.权利要求4所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂 盒的制备方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： （一） 第一试剂， 即Wal ker探针的制备： 1） 将核酸适配体链SYL3C ‑ROX与Zn2+特异性DNAzyme链混合制备得到酶链部分结构被核 酸适配体保护的双链结构的walking核酸链， 待其冷却至室温后将所述walking核酸链与三 羧乙基膦 溶液以摩尔比1： 10 0~1： 1000混合室温反应4  h； 2） 将发夹型核酸链H1退火处理后， 将其与三羧乙基膦溶液以摩尔比1： 100到1： 1000混 合置于室温反应4  h； 3） 将摩尔比为1： 5~1： 10的600  μL步骤1） 反应得到的walking核酸链与 600 μL步骤2） 反 应得到的发夹型核酸链H1， 加入到18  mL 磁核金壳纳米颗粒中形成混合物， 室温反应过夜； 4） 将28 mM巯基聚乙二醇甲氧基SH ‑PEG‑OMe与磁核金壳纳米颗粒按体积比为1： 100~1： 1000的比例， 加入到步骤3） 所制备得到的混合物中， 室温反应10  min后， 在2000  rpm转速下 离心10 min清洗， 最后将产物分散在PBS缓冲液中， 即制备 得到Walker探针； （二） 第二试剂， 即SERS探针的制备 1） 发夹型核酸链H2退火处理后， 将其与三羧乙基膦溶液以摩尔比1： 100到1： 1000混合 置于室温中反应4  h； 2） 将10 μM发夹型核酸链H2与金纳米颗粒以体积比为1： 5~1： 10室温混合过夜， 然后在4   h内少量多次加入2  M 的NaCl对探针进行老化； 3） 将100 μM拉曼信号分子5,5 ’ ‑二硫代双(2 ‑硝基苯甲酸)与金纳米颗粒以体积比1： 10 ~1： 20， 加入步骤2） 得到的混合物中， 反应3小时； 4） 离心去除上清液， 用PBS溶 液分散离心沉积物得到SERS探针； （三） 第三试剂的制备： 将七水合硫酸锌溶解于超纯水中配制得到辅助DNAzyme特异性 切割底物核酸链的硫酸锌溶 液。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114942223 A 26.权利要求4所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒在乳腺癌循环肿瘤细胞MCF ‑7 检测中的非诊断性应用， 其特 征在于， 所述应用步骤 包括： 1） 在PBS缓冲液中加入MCF ‑7细胞， 得到样品溶液， 备用； 其中， 所得到的样品溶液中 MCF‑7细胞的浓度范围为5~1000 cells/mL； 2） 将第一试剂、 第二试剂、 第三试剂与含有不同数目的待检测细胞MCF ‑7的样品溶液混 合； 3） 将步骤2） 处理得到的混合样品用PBS缓冲液磁性分离清洗多次后进行SERS测试， 检 测得到不同数目的待检测细胞MCF ‑7的SERS光谱， 获得5,5 ’ ‑二硫代双(2 ‑硝基苯甲酸)， 即 DTNB在1331 cm‑1特征峰信号强度I1331和ROX在1500  cm‑1特征峰信号强度I1500的比值IR(IR = I1331 /I1500)， 根据 SERS检测试剂盒的工作曲线， 计算得到SERS检测试剂盒检测MCF ‑7细胞 的检测限。 7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒在乳腺癌循环肿瘤细胞 MCF‑7检测中的非诊断性应用， 其特征在于， 所述步骤3） 中共培养条件为在37℃， 300  rpm的 恒温混匀仪中培 养60分钟。 8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒在乳腺癌循环肿瘤细胞 MCF‑7检测中的非诊断性应用， 其特 征在于， 所述应用步骤 还包括， 在外周血提取样本中加入MCF ‑7细胞， 得到样品溶液备用， 其中， 所得到的样品溶液中 MCF‑7细胞的浓度范围为75~600 cells/mL； 将第一试剂、 第二试剂、 第三试剂与含有不同数 目的待检测细胞MCF ‑7的样品溶液混合； 将上述处理得到的混合样品用PBS缓冲液磁性分离 清洗多次后进行SERS测试， 检测得到SERS光谱， 获得DTNB在1331  cm‑1特征峰信号强度I1331 和ROX在1500  cm‑1特征峰信号强度I1500的比值IR(IR =I1331 /I1500)， 根据SERS 检测试剂盒在 PBS缓冲液样 本中得到的工作曲线， 计算得到模拟临床样本中循环肿瘤细胞浓度， 表征得到 检测试剂盒的实用性能。 9.根据权利要求6 ‑8任一项所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂 盒在乳腺癌循环肿 瘤细胞MCF ‑7检测中的非诊断性应用， 其特征在于， 所述步骤2） 中第一试剂、 第二试剂、 第三 试剂以体积比为1： 0.2： 1~1： 2： 1与含有不同数目的待检测细胞M CF‑7的样品溶 液混合。 10.根据权利要求9所述的循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒在乳腺癌循环肿瘤细胞 MCF‑7检测中的非诊断性应用， 其特征在于， 所述核酸适配体SYL3C ‑ROX链的碱基序列如SEQ   ID NO.1所示、 所述Zn2+特异性DNAzyme链的碱基序列如SEQ  ID NO.2所示、 所述发夹型核酸 链H1的碱基序列如SEQ  ID NO.3所示、 所述发夹型核酸链H2的碱基序列如SEQ  ID NO.4所 示。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114942223 A 3