ICS 65.160 B 35 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 962—2020 烟草疫霉土壤带菌定量技术规程 2020 - 04 - 26 发布 云南省市场监督管理局 2020 - 07 - 26 实施 发 布 DB53/T 962—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省烟草专卖局（公司）提出。 本标准由云南省烟草标准化技术委员会（YNTC12）归口。 本标准起草单位：云南省烟草农业科学研究院、云南农业大学、云南省烟草质量监督检测站、云南 省烟草公司大理州公司、云南省烟草公司昆明市公司。 本标准主要起草人：方敦煌、肖炳光、夏振远、曾建敏、秦西云、童治军、姬广海、孙浩巍、范志 勇、徐兴阳。 I DB53/T 962—2020 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本标准第4.5条与ZL201510635459.3 《一种土壤烟草黑胫病发病潜力的预测方法》相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他同意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何组 织或者个人在实施该地方标准时实施专利。相关信息可通过以下联系方式获得： 专利发明人：方敦煌、李永平、肖炳光、曾建敏、童治军 专利权人：云南省烟草农业科学研究院 地址：云南省昆明市五华区圆通街33号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利 的责任。 II DB53/T 962—2020 烟草疫霉土壤带菌定量技术规程 1 范围 本标准规定了烟草疫霉菌定量检测以及土壤带菌量等级划分等要求。 本标准适用于烟草疫霉菌的定量检测，烟草疫霉菌土壤带菌量等级划分。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 23222 烟草病虫害分级及调查方法 GB/T 23224 烟草品种抗病性鉴定 GB/T 25241.1 烟草集约化育苗技术规程 第1部分：漂浮育苗 GB/T 25241.2 烟草集约化育苗技术规程 第2部分：托盘育苗 GB/T 25241.3 烟草集约化育苗技术规程 第3部分：砂培育苗 NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和储存 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 烟草疫霉菌 烟草疫霉菌（Phytophtora nicotianae Breda）是烟草黑胫病的病原菌，在土壤中以休眠体（如厚垣 孢子、菌丝体等）的形态存在，休眠体萌发后形成游动孢子囊，再释放游动孢子侵染烟草。在一个烟草 生长季节中能够连续繁殖多代，不断释放游动孢子，通过流水或雨水飞溅传播形成再侵染。 4 烟草疫霉菌定量检测 4.1 土样采集与前处理 在土地平整后、理墒前按NY/T 1121.1采集土壤样品，过2 mm筛制备土壤测试样品。 4.2 土壤稀释平板菌落计数法定量检测 4.2.1 选择性培养基的制备 选择性培养基按照附录A配制。 4.2.2 土壤稀释平板菌落计数法定量 4.2.2.1 土壤悬浮液稀释 1 DB53/T 962—2020 称取过筛后的土壤测试样品l0 g，放入250 mL带塞三角瓶中，再加入已灭菌的40 mL 0.25%水琼脂， 置于漩涡振荡器上充分混匀，5倍系列稀释，每份土样3次重复。 4.2.2.2 涂布平板 -2 -3 -4 吸取5 、5 、5 土壤稀释液各200 μL，涂布于选择性培养基平板上，每份样品每个稀释梯度涂布5 个平板，置于（24～26）℃恒温培养箱中培养（48～72）h后，疫霉菌在选择性培养基上形成丛状菌落。 4.2.2.3 菌落计数 挑选菌落形态较易区分、菌落数（称为菌落形成单位 Colony-Forming Units，简称cfu）在（5～ 15）个的平板，标记疑似菌落，将同一样品相同稀释度的5个平板中的菌落数相加计数。 每1 g土样形成的疑似菌落数计算公式为每1 g土壤（干重）中烟草疫霉菌数量＝（同一稀释度3次 重复的菌落平均数×稀释倍数）/（1-土壤含水量） 4.2.2.4 校正定量 挑取同一样品（30～50）个疑似烟草疫霉菌菌落5 mm×5 mm的菌丝块，按照附录B鉴定疑似菌落， 判别、统计阳性结果的百分比，以此校正定量各土样中的烟草疫霉菌含量。 4.3 荧光定量 PCR 检测 4.3.1 烟草疫霉菌 DNA 提取 按附录B提取烟草疫霉菌DNA，保存于-20 ℃冰箱中备用。 4.3.2 荧光定量 PCR 引物 用于荧光定量PCR的特异性引物核苷酸序列为： ——ParA1 F: 5’-CATT GAGTAGCCAGAGTCCGTC-3’； ——ParA1 R: 5’-CCACCACGCAGCAAACTGCGGC-3c’。 4.3.3 实时荧光定量 PCR 检测 4.3.3.1 反应程序 95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s ，40个循环。PCR扩增结束后 进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线的程序为：95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，从57 ℃ 开始每升高0.5 ℃保持10 s，连续升高80次，至95 ℃为止。 4.3.3.2 标准曲线构建 利用含烟草疫霉菌DNA目的片段的重组质粒作为标准品，使用SYBR GreenⅠ荧光染料法，以10倍稀 释浓度梯度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR，构建标准曲线，并确定荧光定量PCR的灵敏度。 4.3.3.3 土壤检测 按照4.3.1方法提取烟草疫霉菌DNA，利用土壤真菌提取试剂盒提取试点土样总DNA，采用4.3.3.1 的反应程序进行荧光定量PCR检测。 4.4 叶片诱饵法定量检测 4.4.1 2 叶片诱饵的制备 DB53/T 962—2020 以GB/T 23224测定的感黑胫病烟草品种为材料，采用GB/T 25241.1、GB/T 25241.2、GB/T 25241.3 任意方法之一育苗，取苗龄35～45 d的幼苗移栽至直径10 cm、深（6～8）cm的小花盆或边长10 cm、深 （6～8）cm的穴盘托盘湿润育苗至（6～7）叶期，取健康中部叶（1～2）片，在叶片中部用5 mm打孔器 打取叶圆片，作为叶片诱饵。 4.4.2 游动孢子的诱捕 4.4.2.1 平板菌丝游动孢子的诱导释放 将烟草疫霉菌活化（2～3）次，接种至燕麦培养基平板，（24～26）℃培养（7～10）d，再用10 % 的V8培养液诱导游动孢子囊，8 ℃低温释放游动孢子。 4.4.2.2 游动孢子含量测定 微量加样器取5 μL 游动孢子悬浮液，在洁净载玻片上拖成连续细长的薄层条带，显微计数测算孢 子浓度。 4.4.2.3 带菌土壤悬浮液的制备 取5 g研磨并通过2 mm筛网的灭菌干土均匀混入盛有10 mL 300 cfu/mL、600 cfu/mL、900 cfu/mL、 1200 cfu/mL、1800 cfu/mL游动孢子悬浮液的50 mL烧杯中，制备不同浓度梯度的人工添加游动孢子的 土壤悬浮液。 4.4.2.4 诱捕与计数 土壤悬浮液静置2 h，取叶片诱饵（15～20）片漂浮在液面上，叶片诱饵互不重叠，（24～26）℃ 诱捕（2～4）h，10×20或20×20倍显微观察，计数所有叶片诱饵圆片外缘伤口四周诱捕到的游动孢子数 量，每浓度梯度重复3次，取平均值作为叶片诱捕游动孢子数量。 4.4.3 诱捕量与带菌量的回归分析与验证 以叶片诱捕游动孢子数量（诱捕量）为自变量、土壤悬浮液的游动孢子含量（带菌量）为因变量， 采用数据处理软件建立指数回归方程，再用200 cfu/mL、400 cfu/mL、800 cfu/mL、1400 cfu/mL、2000 cfu/mL 游动孢子悬浮液对回归方程进行验证。 4.4.4 土壤样品实测 4.4.4.1 土壤中游动孢子的诱导释放 取50 g研磨并通过2 mm筛网的土样装入带有下盖的土壤环刀内，置于1/3～1/2环刀土壤高度的盛水 盘内渗透吸水至饱和，去除多余水分，露天静置4 d～5 d，期间每1 d早晚喷淋感黑胫病烟草品种烟苗 根系分泌物保湿1次，维持土壤含水量的饱和状态，利用白昼温差、间歇喷淋诱导土壤产生并释放游动 孢子。 4.4.4.2 诱捕计数与带菌量计算 将处理土壤转移至250 mL烧杯内，100 mL灭菌水清洗带有下盖的土壤环刀，并将洗下的水加入烧杯 内，搅匀，按4.4.2.4的方法进行诱捕与计数，再将3次测定的平均值代入4.4.3建立的回归方程，计算 每1 g土壤样品的带菌量。 4.5 感病品种土壤假植测定最高发病率定量带菌量 3 DB53/T 962—2020 4.5.1 土壤样品的采集及其栽培基质的制作 测定的田块对角线5点取土样，取样深度为（20～30） cm的耕层土壤，每点取（3.0～5.0）kg，辗 碎成粒径为（0.2～0.5）cm的土壤颗粒，剔除杂物，混匀，洁净水（无烟草病原）湿润，控制土壤含水 量为（55～65）%，制作为栽培基质，装入长约 30 cm、宽约60 cm、深约15 cm、筛孔边长（0.4～0.6）cm 筛筐内，装土高度（10～12）cm每筛筐1个重复，共重复5次，多余的土壤样品分别标示存放备用。 4.5.2 感病品种假植与培育 按4.4.1的方法培育幼苗，再挑选生长整齐的烟苗，拔出，剪除1/4～1/3的末端根系，形成根创伤 后，按株距5 cm、行距10 cm移栽至4.5.1的筛筐中，将筛筐置于配套的托盘内，在托盘内注入土壤厚度 1/3～1/2的洁净水，渗透吸水至饱和，去除多余水分，在长 （560～590）cm、宽 （140～145）cm、高 （100～120）cm可拆卸田间塑料小拱棚内静置 （4～5）d，期间每1 d早晚喷淋保湿1次，维持土壤含水 量的饱和状态，5 d后向托盘中注水，水的深度为土壤厚度的1/3～1/2，以维持土壤湿润，在（15～28） ℃、相对湿度75 %以上、自然光照/黑暗交替的可拆卸田间塑料小拱棚中继续培养。 4.5.3 病害调查 移栽烟苗后的第3 d观察发病情况，每7 d调查1次病情，共调查5次，烟草黑胫病以株为单位调查， 以产生明显病斑至烟苗凋萎记作发病，以无病斑、烟苗直立、生长正常记作不发病，每发病株采用4.2.2.4 或者4.3.3.3方法校验，调查所有烟株，按GB/T