ICS 11.220 B 41 DB14 山 西 省 地 方 标 准 DB 14/ T 1789—2019 禽流感病毒 H7 亚型抗体竞争 ELISA 检测方法 2019 - 06 - 25 发布 山西省市场监督管理局 2019 - 08 - 25 实施 发 布 DB14/ T 1789—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 缩略语 ............................................................................ 1 3 实验原理 .......................................................................... 1 4 实验条件 .......................................................................... 1 5 实验方法 .......................................................................... 1 6 结果判定 .......................................................................... 2 7 注意事项 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 试剂配制方法 .................................................... 4 I DB14/ T 1789—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由山西省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山西省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山西省动物疫病预防控制中心、武汉科前生物股份有限公司、华中农业大学。 本标准主要起草人：雷宇平、王仲兵、郎小兵、金梅林、董晓辉、但汉并、卢月、胡明明、王治维、 芦俊彦、樊慧锦、宁艳、雷冲、王锦、刘田勇。 II DB14/ T 1789—2019 禽流感病毒 H7 亚型抗体竞争 ELISA 检测方法 1 范围 本标准规定了应用竞争酶联免疫吸附法检测血清中禽流感病毒H7亚型抗体方法的缩略语、实验原 理、实验条件、实验方法、结果判定和注意事项。 本标准适用于禽流感病毒H7亚型抗体的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay） OD：光密度值(optical density) HRP：辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase) 3 实验原理 本标准采用竞争酶联免疫吸附法，该方法利用抗原抗体反应具有特异性的特点，将特异性的H7亚型 禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面，将待检血清和特异性酶标单抗同时加入包被板 孔。由待检血清中的抗体和酶标单抗竞争与包被抗原结合，待检血清中抗体越多，结合在包被抗原上的 酶标单抗就越少，阳性血清反应呈色浅于阴性血清。 4 实验条件 4.1 实验室环境 实验操作在15 ℃～25 ℃下进行。未灭活的感染性材料的实验活动，应在Ⅱ级生物安全柜内进行。 4.2 仪器 Ⅱ级生物安全柜、离心机、酶标仪、洗板机（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒温箱。 5 实验方法 5.1 实验材料 禽流感病毒H7亚型包被抗原、HRP标记的禽流感病毒H7亚型HA蛋白的单克隆抗体（酶标记物）、底 物液、终止液、样品稀释液、洗涤液、包被液、封闭液。 试剂配制方法见附录A。 5.2 样品准备 1 DB14/ T 1789—2019 取动物全血，待血液充分凝固后，4 000 r/min离心10 min，收集血清。也可等凝固后自然析出血 清。血清应清亮，无溶血。 样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护。 5.3 包被 用包被液将包被抗原稀释至工作浓度2 μg/mL，加至抗原包被板中，每孔100 μL，放置2 ℃～8℃ 条件下，包被15 h。 5.4 封闭 弃去包被液，每孔加入封闭液200 μL，置37 ℃±1 ℃孵育2 h；弃去封闭液，拍干，再置37 ℃± 1 ℃干燥2 h。 5.5 待检血清的稀释 待检血清在血清稀释板中做10倍稀释。 5.6 操作步骤 5.6.1 加样 取抗原包被板，先用洗涤液洗涤抗原包被板1次，稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取50 μL，加至抗原包被板中，每板待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔，同时加入酶标记物50 μL。轻 轻振匀孔中样品，置37 ℃±1 ℃下温育45 min。 5.6.2 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200μL，重复洗涤5次，最后一次拍干。 5.6.3 加酶标抗体 将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体用封闭液1:1000稀释，每孔加100 μL，37 ℃±1 ℃放置30 min。 5.6.4 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200μL，重复洗涤5次，最后一次拍干。 5.6.5 加底物液 每个反应孔加入底物液100μL，置20 ℃～25 ℃下避光显色15 min。 5.6.6 加终止液 每孔加终止液50μL，10 min内在酶标仪上测定450 nm波长处的OD值。 6 结果判定 试验成立的条件：阴性对照的平均OD450nm值大于1.0，阳性对照的抑制率（PI值）大于50%。 S=样品孔OD450nm值，N=阴性对照孔平均OD450nm值。 PI值=(1-S/N)×100%。 2 DB14/ T 1789—2019 若被检样品的抑制率小于40%，该样品判为禽流感病毒H7亚型抗体阴性。若被检样品的抑制率大于 或等于40%，该样品判为禽流感病毒H7亚型抗体阳性。 7 注意事项 7.1 人员防护 实验过程中注意做好个人的安全防护工作。 7.2 样品处理 血清应在Ⅱ级生物安全柜中析出。 7.3 废弃物处理 操作区应有专门的固体和液体废弃物收集容器。废弃物经高压灭菌后按相关规定处理。 3 DB14/ T 1789—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制方法 A.1 包被液 包被液为碳酸盐缓冲液（0.025 mol/L，pH 9.6）。将下列试剂按序加入1 000 mL规格的容器中， 加800 mL蒸馏水充分溶解，定容至1 000 mL。 碳酸钠（Na2CO3） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO3） 2.93 g 加蒸馏水至 1 000 mL A.2 洗涤液 氯化钠（NaCl） 氯化钾（KCl） 十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 磷酸二氢钾（KH2PO4） Tween-20 加蒸馏水至 8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 0.5 mL 1 000 mL A.3 底物液 商品化TMB显色液。 A.4 终止液 98%浓硫酸（H2SO4） 加蒸馏水至 108.8 mL 1 000 mL A.5 样品稀释液 氯化钠（NaCl） 氯化钾（KCl） 十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 加蒸馏水至 8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 1 000 mL A.6 封闭液 牛血清白蛋白（BSA） 4 5.0 g DB14/ T 1789—2019 氯化钠（NaCl） 氯化钾（KCl） 十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 硫柳汞钠 加蒸馏水至 8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 0.2 g 1 000 mL _________________________________ 5