ICS 65.020.30 B 41 湖 DB43 南 省 地 方 标 准 DB43/T 1670—2019 非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光PCR法 Detection of African Swine Fever Virus Real-time PCR without DNA Extraction Method 2019-10-15发布 湖南省市场监督管理局 2019-12-15实施 发 布 DB43/T 1670—2019 目 次 前言……………………………………………………………………………………………………… Ⅱ 1 范围…………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义…………………………………………………………………………………………… 1 4 主要仪器设备………………………………………………………………………………………… 1 5 主要耗材……………………………………………………………………………………………… 1 6 试剂…………………………………………………………………………………………………… 2 7 样品处理……………………………………………………………………………………………… 2 8 样品检测……………………………………………………………………………………………… 3 9 结果判定……………………………………………………………………………………………… 3 10 生物安全要求……………………………………………………………………………………… 3 附录 A（规范性附录） 试剂的配制………………………………………………………………… 4 I DB43/T 1670—2019 前 言 本标准按 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省畜牧水产局提出，由湖南省农业农村厅归口。 本标准起草单位：湖南省动物疫病预防控制中心、湖南国测生物科技有限公司。 本标准主要起草人：何世成、王昌建、刘道新、喻正军、石建、范叶、林源、唐小明、黄建龙。 II DB43/T 1670—2019 非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了免核酸提取检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光 PCR 方法。 本标准适用于我省范围内开展非洲猪瘟病毒核酸快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 非洲猪瘟 （African Swine fever，ASF） 由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染 病，其发病率和病死率均可达到 100%，是世界动物卫生组织（OIE）的法定报告传染病，在我国属于一 类动物疫病。 3.2 荧光 PCR 实时荧光聚合酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction） 。 4 主要仪器设备 荧光 PCR 仪；台式离心机（转速≥12 000 r/m） ；小型离心机（转速≥6 000 r/m） ；-20℃冰箱；微 量移液器[（0.2～2.5）μL、 （1～10）μL、 （10～100）μL、 （20～200）μL、 （100～1 000）μL 等规 格]；组织匀浆仪；高压灭菌锅；分析天平（精度 0.01g） ；生物安全柜。 5 主要耗材 无 DNase/RNase 1.5 mL 离心管；与荧光 PCR 仪匹配的 PCR 薄壁管或 8 联排管；与移液器配套的各 规格吸头。 1 DB43/T 1670—2019 6 试剂 6.1 引物与探针 引物和探针的设计基于 ASFV vp72 基因序列，序列如下： a) 上游引物：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’ ，使用浓度为 20 μmol/L。 b) 下游引物：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’ ，使用浓度为 20 μmol/L。 c) 探针：5’-FAM-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’ ，使用浓度为 10 μmol/L。 6.2 核酸释放剂 核酸释放剂配制方法见附录 A.1。 6.3 荧光 PCR 试剂 6.3.1 Taq DNA 聚合酶，浓度为 5 U/μL。 6.3.2 尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG 酶） ，浓度为 2 U/μL。 6.3.3 dNTPs：由等量 dATP、dUTP、dGTP、dCTP 组成，终浓度为 25 mmol/L。 6.3.4 2×PCR 缓冲液：配制方法见附录 A.2。 6.4 阴性与阳性对照 6.4.1 阳性对照：灭活的非洲猪瘟病毒阳性样品，Ct 值≤30，-20℃保存备用。 6.4.2 阴性对照：非洲猪瘟病毒核酸阴性样品，-20℃保存备用。 7 样品处理 7.1 样品类型 猪脾脏、淋巴结等组织样品，血清、抗凝血，拭子样品。样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 的规定执行。 7.2 样品预处理 不同类型样品预处理方法如下： a） 组织样品：剪取待检组织约 50 mg 置于 1.5 mL 离心管中，加入 200 μL PBS（0.01 mol/L ， pH 7.2） ，使用组织匀浆仪研磨成悬液，12 000 r/m 离心 1 min，取上清待检。 b） 血清或抗凝血样品：无需预处理。 c） 拭子样品：准备 1.5 mL 离心管，加入 1 mL PBS（0.01 mol/L ，pH 7.2） ，将拭子置入管中， 振荡后取浸泡液待检。 7.3 样品灭活 将预处理后的待检样品经 60℃ 30 min 灭活。 7.4 样品保存 样品在 2℃～8℃条件下保存应不超过 24 h，超 24h 后检测需冷冻保存。 2 DB43/T 1670—2019 8 样品检测 8.1 核酸释放 8.1.1 在样品制备区，吸取核酸释放剂 100 μL 于 1.5 mL 离心管中，加入已灭活待检样品 10 μL～ 20 μL，充分混匀。85℃～95℃处理 10 min，然后 12 000 r/m 离心 1 min，取上清液作为模板立即进 行荧光 PCR 检测。同时设立阴性对照、阳性对照。 8.1.2 待检样品也可使用商品化病毒核酸提取试剂盒进行 DNA 提取，操作按试剂盒说明书进行。 8.2 荧光 PCR 检测 8.2.1 反应体系配制：根据待检样品数量，在试剂准备区按比例配制反应体系：Taq DNA 聚合酶 0.5 μL、 UNG 酶 0.25 μL、dNTPs 0.25 μL、2×PCR 缓冲液 12.5 μL、上下游引物各 0.75 μL、探针 0.5 μL、 无 DNase/RNase 水 4.5 μL。充分混匀后，20 μL/管分装，转移至样品制备区加样。 8.2.2 加样：吸取 5 μL 模板加至反应体系，转移到扩增区。 8.2.3 扩增：将反应管置于荧光 PCR 仪中，选择 FAM 通道进行检测，设置反应体系为 25μL，反应程 序如下：第一阶段，预反应 50℃/2 min；第二阶段，预变性 95℃/2 min；第三阶段，95℃/15 s，退火、 延伸、荧光收集 60℃/30 s（收集荧光） ，40 个循环；第四阶段，冷却 25 ℃/10 s。 9 结果判定 9.1 基线设置 反应结束后，保存结果，仪器对结果进行自动分析，给出 Ct 值。注意查看结果的扩增曲线的形状， 存在 Ct 值的结果呈 S 型扩增曲线。也可根据实际情况自行调整：基线起点值调至 3～15、基线终点值 调至 5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，使各项参数符合下述“9.2 实验有效性” 中的要求。 9.2 实验有效性 当阳性对照 Ct 值≤30、呈 S 型扩增曲线，阴性对照无 Ct 值时，实验成立，否则实验结果无效。 9.3 结果判定 样品 Ct 值≤35 且呈 S 型扩增曲线，结果判定为 ASFV 核酸阳性。 样品 Ct 值在 35～40 之间，结果判定可疑，需重复检测一次，复检无 Ct 值，判定为 ASFV 核酸阴性， 反之为阳性。 样品无 Ct 值或无 S 型扩增曲线，结果判定为 ASFV 核酸阴性。 10 生物安全要求 检测过程及实验室废弃物处置应遵守 GB 19489、NY/T 1948 等生物安全管理相关要求。 3 DB43/T 1670—2019 附录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 核酸释放剂配制方法 NaOH 0.8 g KCl 3.73 g EDTA 0.37 g Triton X-100 1 mL 加无 DNase/RNase 水充分溶解，并定容至 1000 mL，分装备用。 A.2 2×PCR 缓冲液配制方法 Tris 碱 24.2 g MgCl2·6H2O 2.03 g KCl 7.46 g (NH4)2SO4 1.3 g 甘油 80 ml 加无 DNase/RNase 水充分溶解，使用浓盐酸将溶液 pH 值调至 8.3，并定容至 1000 mL，分装备用。 4