ICS 07.080 B 16 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1748—2018 大灰蛞蝓检疫鉴定方法 Detection and identification of Limax maximus Linnaeus 2018 - 04 - 03 发布 福建省质量技术监督局 2018 - 07 - 03 实施 发 布 DB35/T 1748—2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语与定义 ........................................................................ 1 4 大灰蛞蝓基本信息 .................................................................. 1 5 鉴定依据 .......................................................................... 2 6 器具与试剂 ........................................................................ 2 7 现场检疫 .......................................................................... 2 8 实验室鉴定 ........................................................................ 2 9 结果评定 .......................................................................... 3 10 标本处理和保存 ................................................................... 3 附录 A（资料性附录） 大灰蛞蝓寄主、地理分布及危害性 .................................. 5 附录 B（规范性附录） 大灰蛞蝓实时荧光 PCR 检测 ........................................ 6 附录 C（资料性附录） 大灰蛞蝓形态特征 ................................................ 7 I DB35/T 1748—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局、福建农林大学。 本标准主要起草人：王沛、周卫川、陈泰林、王宇、林阳武、丁红丽、林俊宏。 II DB35/T 1748—2018 大灰蛞蝓检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了大灰蛞蝓（Limax maximus Linnaeus, 1758）的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境运输工具、原木、木质包装材料、种苗、花卉、水果、蔬菜等携带大灰蛞蝓的 检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 3067-2011 软体动物常规检疫规范 3 术语和定义 SN/T 3067-2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生殖器 genitalia 蛞蝓为雌雄同体、异体交配的动物，雄性生殖系统主要包括输精管、阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌 等部分，雌性生殖系统主要包括受精囊、受精囊柄等部分。生殖系统的特征在种、属、科级阶元都较为 稳定，是分类的重要依据。 3.2 阴茎 penis 阴茎系统一般由阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌和鞭状体组成，其中后三者常因种类不同而缺失。大 灰蛞蝓无鞭状体。 3.3 受精囊 bursa copulatrix 蛞蝓的受精器官，由受精囊和受精囊柄组成，其中受精囊柄的形态和有无分支常用于分类鉴定。 3.4 软体 soft body 蛞蝓的身体，其内有退化的贝壳即盾板。软体的颜色和长度可用于分类。 4 大灰蛞蝓基本信息 以下列出大灰蛞蝓的基本信息，其他信息参见附录A。 中文名：大灰蛞蝓；豹纹蛞蝓。 英文名：great grey slug; leopard slug。 学名：Limax maximus Linnaeus, 1758。 1 DB35/T 1748—2018 异名：Limax cinereus Lister, 1678；Limax cinereus Muller, 1774； Limacella parma Brard, 1815；Limax maculatus Nunneley, 1837；Limax cellarius Lessona et Polonera, 1882；Limax carbonarius albanicus Jaeckel, 1954。 分类地位：软体动物门 Mollusca，腹足纲 Gastropoda，柄眼目 Stylommatophora，蛞蝓科 Limacidae， 利迈科斯属 Limax。 5 鉴定依据 传播方式和传播途径是确定现场检疫的依据。软体、生殖系统形态特征和分子生物学特性是实验室 鉴定的依据。 6 器具与试剂 6.1 仪器和用具 仪器：体视显微镜、微型离心机、恒温金属浴、荧光PCR仪、低温冰箱。 用具：放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4 mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、白瓷盘、 培养皿、镊子、剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针、解剖腊盘、标签、移液枪、1.5 mL离心管、八连排 荧光PCR反应管。 6.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组 DNA 提取试剂盒、实时荧光 PCR 检测试剂（见附录B）、 ddH2O。 7 现场检疫 7.1 对来自疫区（参见附录 A）的集装箱、木质包装材料必须重点检查，仔细观察集装箱的底部和四 角部位以及所装货物与木质包装材料是否有蛞蝓。注意阴暗蔽光处的检查，用手电筒仔细寻找蛞蝓的行 迹。对来自疫区的原木、盆景、苗木、水果等未经加工的植物性原材料也应认真检查，对可能被蛞蝓污 染的物品可用高压水枪冲洗后再检查。 7.2 蛞蝓爬行过后，都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蛞蝓污染的重要依据。发现 蛞蝓标本，装入塑料自封袋或标本瓶带回实验室做进一步的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其它细碎 衬垫材料时，需过筛检查是否有卵或幼体。 8 实验室鉴定 8.1 测量、观察、解剖和饲养 8.1.1 用游标卡尺测量蛞蝓软体的长度。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和蛞蝓的形态特征。 8.1.2 将闷杀处理（见 10.1）后的标本，按照 SN/T 3067-2011 中 8.3.1 进行软体解剖，分离出生殖 系统。 8.1.3 单独查获的卵粒，按照 SN/T 3067-2011 中 8.4 方法，将其孵化和饲养为成年蛞蝓后，再做鉴 定。 2 DB35/T 1748—2018 8.2 利迈科斯属鉴定特征 软体中型至大型，外套膜大约覆盖软体的1/4。呼吸孔位于外套膜中部靠后位置，龙骨短小，清晰 可见。阴茎长，管状，卷曲缠绕，无鞭状体。阴茎和牵引肌交叉相连。输精管插入阴茎顶部靠上位置。 8.3 大灰蛞蝓鉴定特征 8.3.1 卵 卵相互粘连呈簇状，透明，有弹性，颜色稍发黄，大小为6 mm×4.5 mm（参见附录C中图C.1）。 8.3.2 软体 体长10 cm～20 cm，分布大约48条长的不连续的纵向条纹，尾部有一较短龙骨。软体底色多变，呈 浅灰色，褐色或者黄白色，常常布满黑色斑点或纵向条斑。斑点形状多变。腹足底部灰色或者黄灰色， 边缘颜色比较浅，布满一排黑色结节。触角细长。生殖孔位于右触角基部靠上位置。盾片椭圆形，长度 大概是软体的1/3，颜色与软体一致。盾片前部圆润，后部隆起成角，当身体蠕动时形成弓形。呼吸孔 位于外套膜中部靠后位置。粘液颜色多变，黏性小（参见附录C中图C.2）。 8.3.3 生殖系统 两性腺长，通过两性管与输精卵管相连。输精卵管粗而卷曲，向下延伸分成输精管及输卵管。输精 管插入阴茎末端上部。阴茎长，上部连接一个粗壮的阴茎牵引肌。阴茎下部与输卵管直接相连，阴道不 明显。受精囊柄在阴茎下端，位于阴茎与输卵管交接处（参见附录C中图C.3）。 8.3.4 实时荧光 PCR 检测 以大灰蛞蝓为阳性对照，其他非大灰蛞蝓为阴性对照，同时以ddH2O代替模板作为空白对照。按附 录B方法分别提取样品和对照的DNA、进行实时荧光PCR检测，具体操作按照附录B。 9 结果评定 以软体形态为基本鉴定依据，生殖器解剖形态为辅助鉴定特征，符合 8.3.2 或同时符合 8.3.3 形 态特征的蛞蝓鉴定为大灰蛞蝓 （Limax maximus Linnaeus, 1758）。单独查获的卵粒符合 8.3.1 形态 特征，需通过孵化和饲养实验（见 SN/T 3067-2011 中的8.4），做进一步的鉴定。符合 8.3.4 作为前 期初筛或分子佐证。 10 10.1 标本处理和保存 标本处理 10.1.1 将蛞蝓置于盛满水的瓶中，盖上瓶盖，进行闷杀，蛞蝓在慢慢窒息的死亡过程中，逐渐伸展身 体；或逐渐加入少量硫酸镁，进行麻醉闷杀。 10.1.2 将闷杀后伸展的蛞蝓标本置于无水乙醇中浸泡 1 d～2 d，然后在 75% 的乙醇溶液中固定，每 隔 1 d～2 d 换 1 次乙醇溶液，共换 3～4 次，便可长期保存于 75% 的乙醇溶液中。解剖后的生殖系统 可直接保存于 75%的乙醇溶液中。 3 DB35/T 1748—2018 10.2 保存时间 经处理后的标本，至少妥善保存6个月，并注明时间、产地、寄主、采集人等