SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1146.2—2017 代替SN/T1146.2—2009 烟草环斑病毒分子生物学检测方法 Molecular detection of Tobacco ringspot virus 行业标准信息服务平台 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1146.2—2017 前 言 SN/T1146共分为3部分： 第1部分：植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法； 第2部分：烟草环斑病毒分子生物学检测方法； 第3部分：烟草环斑病毒检疫鉴定方法。 本部分为SN/T1146的第2部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替SN/T1146.2一2009《烟草环斑病毒分子生物学检测方法》。 本部分与SN/T1146.2一2009相比，主要技术差异如下： 附录C核酸抽提中增加了磁珠吸附法和商品化试剂盒法； PCR引物有所调整； -增加了RT-LAMP检测方法； 增加了缓冲液的配制方法； 一删除了附录A烟草环斑病毒基本信息。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：杨翠云、于翠、张露茜、胡培龙、焦彬彬、邓丛良、魏梅生、高辉、乔艳艳， 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1146.2—2009。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 1146.2—2017 烟草环斑病毒分子生物学检测方法 1范围 SN/T1146的本部分规定了烟草环斑病毒分子生物学检测的基本原则和方法。 本部分适用于无性繁殖材料、组培苗、鳞球茎和种子苗木中携带的烟草环斑病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1146烟草环斑病毒检疫鉴定方法 3烟草环斑病毒基本信息 中文名：烟草环斑病毒 英文名：Tobacco ringspotvirus 缩写：TRSV 分类地位：豇豆花叶病毒科（Comoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。 传播途径：该病毒可以通过种子、嫁接、机械接种和介体进行传播。传毒介体主要是美洲剑线虫 （Xiphinemaamericanum）；大豆、甜瓜、莴苣、豇豆、千日红、马铃薯和天竺葵等都可种传，大豆种传率 高达40%~100%。 基因组：病毒基因组含两条ssRNA。RNA-1长7.514kb,RNA-2长3.929kb，外壳蛋白基因 1.548 kb。 4方法原理 烟草环斑病毒的血清学和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据。采用RT-PCR、IC-RT PCR、实时荧光RT-PCR和RT-LAMP等分子生物学方法进行该病毒的检测。 服务平 5 仪器设备、用具和试剂 5.1仪器设备 PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系 统、水浴锅、高速冷冻离心机、冰箱、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器、pH 计等。 5.2用具 可调式微量移液器（2μL10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNA酶吸头、无 1 SN/T1146.2—2017 RNA酶离心管、PCR管、磁性分离架和研钵等。 5.3主要试剂 除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯。试验用水应符合GB/T6682中相关规定 烟草环斑病毒抗体、植物总RNA提取试剂盒、纳米磁珠、Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、氯 仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、BstDNA聚合酶、DNA 分子标记物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。 各种缓冲液的配制方法见附录A。 6病毒检测 6.1抽样和制样 按照SN/T1146规定的方法执行。 6.2 2检测方法 RT-PCR(见附录D)和RT-LAMP(见附录E)进行烟草环斑病毒的检测。 7结果判定 样品经RT-PCR,IC-RT-PCR、实时荧光RT-PCR和RT-LAMP几种方法之一检测为阴性时，应判 定样品不携带烟草环斑病毒。 样品经RT-PCR和IC-RT-PCR检测为阳性，需要进行序列测定，如果序列测定结果证实与所检测 的烟草环斑病毒一致，应判定样品携带烟草环斑病毒。 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，应判定样品携带烟草环斑病毒。 样品经RT-LAMP检测为阳性时，需要再经RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR的其中 种分子检测方法验证，结果为阳性时应判定样品携带烟草环斑病毒。 业标准信 8样品保存和结果记录 8.1样品保存 经检测确定携带烟草环斑病毒的样品，应在适合的条件下妥善保存。如种子保存在干燥条件下，种 苗和鳞球茎等试验样品保存在一80℃冰箱中。做好登记和标记工作。 8.2 结果记录 记录包括：样品来源、种类、取样人员、试验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。RT PCR和IC-RT-PCR检测应有电泳图谱及序列测定分析结果，实时荧光RT-PCR应有扩增曲线图谱， RT-LAMP检测应有显色管图片。 2