ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 0 14-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品 体外皮肤致敏试验 -ARE -Nrf2 荧 光素酶试验方法 Cosmetics In Vitro Skin Sensitisation Assay - ARE -Nrf2 Luciferase T est Method 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.规范性引用文件 ……………………………………………………… …………… ……… 3 3.术语和定义 ……………………………………………… ………………………………… 3 4.原理………………………………………………………… ………………… …………… 4 5.测试系统 ………………………………… ………… ………………………… …………… 4 6.仪器与试剂耗材 ………………………………………………………………………… … 4 7.试验方法 ……………………………………………………………………………… …… 5 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海出入境检验检疫动植物与食品检验检疫技术中心、 上海家化联合股份有限公 司、伽蓝（集团）股份有限公司、 上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市 质量监督检验技术研究院 、玫琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物 科技有限公司 有限公司、 汉高（中国）投资有限公司、 广东博溪生物科技有限公司、 东阿阿胶股份有限 公司、上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起草人： 刘春凤、李小林、 陈田、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、万向红、 李琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 4 化妆品体外皮肤致敏试验 -ARE -Nrf2 荧光素酶试验方法 1 范围 本标准规定了体外皮肤致敏试验： ARE -Nrf2荧光素酶实验方法的术语、定义、实验方法。 本标准适用于化妆品原料和成品皮肤致敏体外筛选试验。 本标准可作为皮肤致敏动物试验的替代方法之一。可以结合其他皮肤致敏替代试验，对皮 肤致敏效 应进行综合评价。 本标准可作为其他领域皮肤致敏体外测试的参考方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2285 化妆品体外替代试验实验室规范 3 术语和定义 3.1 DSens细胞系 转染了选择性质粒的 HaCaT角质细胞 3.2 ARE 抗氧化反应元件。 3.3 Keap1 是一种能调节 Nrf 2活性的传感器蛋白。 3.4 Nrf2 参与抗氧化反应通路的转录因子。 3.5 诱导倍数 经受试物处理的细胞的荧光值与溶剂对照荧光值的比率。 3.6 Imax 与溶剂对照相比，荧光素酶活性的最大诱导倍数 3.7 变异系数 通过将标准差除以平均值来计算一组复制数据的变异性的度量。表达式的百分比可以乘以 100。 3.8 EC1.5 荧光素酶基因诱导表达为 1.5倍时的受试物浓度。 3.9 IC 30 细胞活力降低 30%的受试物浓度。 5 3.10 IC 50 细胞活力降低 50%的受试物浓度。 4 原理 DSens是一个基于转染了 选择性质粒的 HaCaT角质细胞系作为检测系统的方法。 Keap1 -Nrf2 -ARE 信号通路可以通过控制抗氧化酶或者蛋白 的表达来保护细胞不受氧化应激的损伤， 该信号通路可以被皮 肤致敏物激活。 DSens细胞系含有荧光素酶基因，由一个与 ARE元件融合的组成性启动子的转录控制。 荧光素酶信号反映了内源性 Nrf2依赖基因的致敏物激活状态，并且证实了重组细胞系中荧光素酶信号 对Nrf2的依赖性。 此方法通过定量检测由 Keap1 -Nrf2 -ARE反应通路激活引起的荧光素酶基因表达情 况，作为皮肤致敏的反应量化指标。 DSens细胞的构建方法：将融合了 SV40 启动子的 ARE元件构建到含有荧光素酶的质粒上，将质 粒转入 HaCaT细胞，利用 G-418筛选稳转细胞株，并通过 PCR的方法确定基因的表达。 5 测试系统 5.1 DSens测试系统 DSens是来源于选择性质粒转染的 HaCaT人角质细胞的永生细胞系，该质粒含有荧光素酶基因。 采用 DMEM细胞培养液，含 FBS和遗传霉素， 1％青霉素和 1％链霉素，于 5％C02、37℃细胞培养箱 常规培养。 5.2 受试物与对照 5.2.1 溶剂对照 1％DMSO作为溶剂对照组 5.2.2 阳性对照 本实验中，采用肉桂醛作为阳性对照，浓度分别为 4，8，16，32，64μmol/L 。 5.2.3 空白对照 测定空白的补偿光密度，孔里加入 DPBS，不含细胞。 5.2.4 受试物浓度 0.976 5625，1.953125，3.90625，7.8125，15.625，31.25，62.5，125，250，500，1000，2000 μmol ／L。 6 仪器与试剂耗材 6.1 仪器 6.1.1 II级生物安全柜 6.1.2 二氧化碳培养箱温度 37 ℃± 1 ℃，湿度 90 %± 5 % ，5 %± 1 % CO 2浓度） 6.1.3 恒温水浴箱（温度 37 ℃± 1 ℃） 6.1.4 荧光读板机 6.1.5 DSens细胞系 6 6.1.6 全波长酶标仪 6.1.7 电子天平 6.1.8 细胞计数仪 6.1.9 离心机 6.1.10 烘箱 6.1.11 移液枪 6.1.12 液氮罐 6.1.13 排枪 6.1.14 细胞冻存盒 6.1.15 振荡器 6.1.16 倒置显微镜 6.2 试剂耗材 6.2.1 DMEM培养基（ Dulbecco's Modified Eagle Medium ） 6.2.2 胎牛血清（ FBS）（ 56 ℃加热灭活 30 min） 6.2.3 0.25 %胰酶 /EDTA 溶液（ Trypsin/EDTA ） 6.2.4 青霉素 /链霉素双抗（工作溶液青霉素（ 100 U/mL ）、链霉素（ 100 µ g/mL ）） 6.2.5 遗传霉素 G-418 6.2.6 二甲基亚砜（ DMSO） 6.2.7 细胞冻存培养基（含 20 % FBS 、10 % DMSO 的DMEM培养基） 6.2.8 磷酸盐缓冲液（ DPBS） 6.2.9 荧光素酶检测试剂盒 6.2.10 反式肉桂醛 6.2.11 CCK -8试剂 6.2.12 无菌离心管 6.2.13 细胞培养瓶及培养板（ 25 cm2、75 cm2培养瓶、 96孔平底细胞培养板）。 7 试验方法 7.1 实验溶液配制 维持培养所用的培养基： 10% FBS 的DMEM细胞培养液 ,加入遗传霉素， 过滤除菌， 加入青霉素 （ 100 U/mL） 、链霉素（ 100 μg/mL ）。 冻存所用的培养基：含有 20％的胎牛血清和 10％DMSO的DMEM 受试物暴露时所用的培养基：含 1％胎牛血清 DMEM培养基，无遗传霉素。 受试物的制备：受试物溶于 DMSO或者培养基中，浓度范围设置为： 0.98-2000 μmol ／L（间隔系7 数为 0.5）的 12个终浓度，确保 DMSO的终浓度在 1%或者更少。阳性物质为肉桂醛，设置 5个浓度， 4-64 μmol／L（间隔系数为 0.5） ，溶剂对照为 DMSO,设置同浓度的六个孔作为参照。 7.2 细胞培养 7.2.1 DSens细胞培养及质控 DSens细胞系应在 ，在 37 ℃± 1 ℃，湿度 90 %± 5 % ，CO 2浓度 5.0 %± 1 % 条件下进行培养，选择 25代之内的细胞进行试验。所有细胞培养相关操作步骤都应在 II级生物安全柜里进行，确保无菌操作。 7.2.2 DSens细胞培养传代 DSens细胞培养到 80%-90%后需要进行传代，吸掉原培养液， DPBS清洗一次， 加入 0.25 %胰酶 /EDTA 溶液（ 25 cm2培养瓶 0.5