SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4708—2016 国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光 PCR检测方法 Detection method of vibrio cholerae and vibrio mimicus by duplex real-time PCR at frontier ports 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4708—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：韩辉、杨宇、吴海磊、谭克为、宋亚京、李海山、徐宝梁。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4708—2016 国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光 PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌的检测方法，包括检测对象、样本采集和处理、操作方 法及结果报告 本标准适用于国境口岸入出境人员、环境水体携带霍乱弧菌（包括01群、0139群和非01群/ O139群霍乱弧菌）和拟态弧菌的分子生物学检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489—2008实验室生物安全通用要求 WS233一2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部令第45号） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 霍乱弧菌VibrioCholerae 弧菌属，革兰氏染色阴性。病人和带菌者是霍乱的主要传染源，病人及带菌者的粪便或排泄物污染 水源或食物后可引起霍乱暴发流行。霍乱有耐热的O抗原和不耐热的H抗原。根据O抗原不同，霍 乱弧菌可分为200多个血清型其中仅O1群和0139群霍乱弧菌产毒株可引起霍乱的流行。 3.2 拟态弧菌Vibrio Mimicus 弧菌属，革兰氏染色阴性。广泛存在于自然界河水、海水和海产品中。是一种人和水产动物共患病 病原菌，可以通过水体和水产品感染人类，已经成为某些地区散发性和流行性腹泻及食物中毒的病原菌 之一。拟态弧菌生化特性与霍乱弧菌极为相似，主要是引起人类急性腹泻 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应 DNA:脱氧核糖核酸 DEPC：焦碳酸二乙酪 FAM:6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团 HEX：六氯-6-甲基荧光素，一种荧光报告基团 1 SN/T 4708—2016 BHQ：黑洞淬灭基团 5检测对象 5.1 疑似感染霍乱弧菌和拟态弧菌的人出境人员的生物样本，如粪便、呕吐物等。 5.2疑似污染霍乱弧菌和拟态弧菌的环境样本，如人境船舶压舱水等。 6生物安全要求 6.1检测工作中的个人防护应按照GB19489—2008的要求进行个人防护。 要求。 6.3使用过的实验用品应遵照GB19489—2008对废弃物的处理要求进行无害化处理。 6.4样本运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的相关规定。 7 仪器和设备 7.1 荧光定量PCR仪。 7.2生物安全柜。 7.3普通冰箱。 7.470℃及以下超低温冰箱。 7.5 普通台式离心机。 高速冷冻离心机（转速可达20000×g）。 7.7 涡旋器。 7.8 微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头。 8试剂 8.1 生理盐水：蒸馏水和NaCI配制浓度为0.9%的生理盐水。 8.2核酸提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司))。 8.3 3核酸抽提液（含0.9%NaCI和0.1%EDTA-Na的混合液）。 慧服务平 8.4实时荧光PCR试剂：用TaKaRa公司的PremixExTaqTM²。 8.5DEPC水。 8.6 实时荧光PCR引物及探针，如下： 霍乱弧菌检测引物和探针： 上游引物FompW:5'-TTGCTGCTAACGTTGGCTTTG-3' 下游引物RompW:5'-CTGCTTTGTAGGTTGCCGTTG-3 探针PompW:5'-FAM-TGCTCAATGATAGCTGGTTCCTCAACGC-BHQ1-3 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品 2