ICS 01.040.11 SN C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5101—2019 国境口岸阿穆尔病毒实时荧光RT-PCR 检测方法 Detection method of Amur virus by real-time fluorescence RT- PCR 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5101—2019 前言 本标准依据GB/T1.1一2009给出的规则编写。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国长春海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国长白海关 本标准主要起草人：刘阳、洪晓坤、姚李四、王玮琳、丁旭、刘勇先、孙舒、张吉、孙晶莹。 业标准信息服务平台 SN/T 5101—2019 国境口岸阿穆尔病毒实时荧光RT-PCR 检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸人出境人员及鼠类感染阿穆尔病毒的荧光RT-PCR检测方法，包括样本采 集、处理，检验、结果判定、报告和生物安全措施 本标准适用于国境口岸人出境人员及鼠类感染阿穆尔病毒的荧光RT-PCR检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部） 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（原中华人民共和国卫生部令第 45号） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 阿穆尔病毒Amurvirus 属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），汉坦病毒属（Hantavirus），一种新发现的种群分型，是分节段的 负链RNA病毒。引起以鼠类为主要传染源的肾综合征出血热，典型临床表现为发热、出血、充血、低血 压休克及肾脏损害。 3.2 逆转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreaction 将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用一步法逆 转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物， 在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”；随 后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最 终使RNA分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。 3.3 实时荧光RT-PCRreal-timefluorescenceRT-PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后PCR扩增的产物进行标记跟踪，利用荧 光信号累积实现实时在线监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。 1 SN/T 5101—2019 本标准加人一对引物的同时加入一条特异性荧光探针，探针两端分别标记荧光报告基团（FAM）和荧光 淬灭基团（BHQ1），PCR扩增时，利用Taq酶的水解作用，使探针上的荧光报告基团远离淬灭基团从而 发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积累的荧光信号。 3.4 Ct值Cycle threshold 在荧光PCR中，每个反应管内的荧光信号量达到设定的值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链反应（Polymerasechainreaction) DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid） FAM：6-羧基-荧光素（6-carboxy-fluorescein） BHQl：一种荧光萍灭基团（Bhqlquenchinggroup） Tm值：核酸融解温度（Meltingtempreture） DEPC：焦碳酸乙二酯（diethylpyrocarbonate) 5检测对象 文本为准 按照国境口岸发现的有发热、出血、充血、低血压休克等肾综合征出血热状症，疑似阿穆尔病毒感染 的染疫嫌疑人及密切接触者。 入出境交通工具、运输设备、货物、行李、邮包等和口岸内的鼠类。 生物安全和PCR防污染要求 6 6.1实验室生物安全应符合GB19489、《人间传染病的病原微生物名录》的规定。 6.2PCR防污染措施按WS/T230的规定执行。 息服务平台 6.3样本运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的相关规定。 7仪器 本方法使用的主要仪器如下： 实时荧光PCR仪及配套PCR反应管。 普通台式离心机。 一高速冷冻离心机：最大离心力20000g。 二级生物安全柜。 微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）及配套带滤芯吸头。 普通冰箱（2℃~5℃、一20℃）。 超低温冰箱（-70℃）。 漩涡振荡器。 高压蒸气灭菌器。 2