ICS 11.220 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2907—2023 溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范 Technical specification for the diagnosis of mannheimia haemolytica 2023-03-10发布 2023-04-10实施 内蒙古自 治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2907 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古蒙微生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司。 本文件主要起草人：王炜、王岩、赵丽霞、韩四娥、孟凯、胡薇。 DB15/T 2907 —2023 1 溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范 1 范围 本文件规定了溶血性曼氏杆菌病的临床诊断、细菌分离与鉴定、 PCR检测和间接 ELISA抗体检测等诊 断技术要求。 本文件适用于牛、羊饲养场 (户)和动物疫病检疫、诊疗单位对牛、羊临床样本和分离培养物中溶血 性曼氏杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 -2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.43 -2001 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Mh：溶血性曼氏杆菌（ Mannheimia haemolytica ） LKTA：白细胞毒素蛋白 A（Leukotoxin A ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase chain reaction ） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic acid ） bp：碱基对（ Base pair ） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（ Deoxyribonucleoside triphosphates ） Taq酶：Taq DNA聚合酶（ Taq DNA polymerase ） TSB：胰蛋白胨大豆肉汤（ Tryptic soy broth ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffer so lution） ELISA：酶联免疫吸附试验（ Enzyme linked immunosorbent assay ） 5 临床诊断 流行病学 由溶血性曼氏杆菌引起的牛、羊呼吸道疾病，一年四季均可发生，秋冬季多见。 DB15/T 2907 —2023 2 临床症状 发病牛、 羊主要临床症状表现为咳嗽、 呼吸困难、 流涕， 并伴有体温升高 40 ℃～42 ℃、 精神沉郁、 厌食等。发病初期动物呼吸速率加快，继而出现严重的呼吸困难，呼吸伴有啰音。 病理变化 临床病理变化以纤维素性渗出性肺炎、大叶性肺炎和胸膜肺炎为主。病理剖检可见：病变肺呈肉样 变、质地坚实、肺水肿、间质增宽、胸腔脏层和壁层均有纤维素附着、胸腔积液呈黄色或红黄色、肺与 胸膜黏连，心包炎。 6 样品采集 主要试剂耗材与器械 除另有规定外，所用试剂均为分析纯。试验用水均符合 GB/T 6682 -2008 二级水规定。 TSB培养基（配制方法见附录 A.1）、0.01 mol/L PBS 溶液（配制方法见附录 A.2）、75%酒精、无菌 采样袋、 5 mL冻存管、 2 mL冻存管、手术剪刀、镊子。 病料采集 6.2.1 将棉签伸入鼻腔或咽部刮取分泌物，所有拭子采完后分别放入盛有 3 mL TSB 培养基的 5 mL冻 存管中，编号，记录。采集的样品密封后，于 2 ℃～8 ℃条件下保存并送到实验室。 6.2.2 将发病牛、羊剖检后取肺和淋巴结组织，编号，记录。采集的样品密封后，于 2 ℃～8 ℃条件 下保存并送到实验室。 6.2.3 采用75%酒精对采血动物颈部静脉表面皮肤进行擦拭消毒，采集 2 mL～5 mL血液，按常规方法 分离血清，编号，记录，于 2 ℃～8 ℃条件下保存并送到实验室。 7 细菌分离与鉴定 试剂耗材 绵羊血琼脂 平板（配制方法见附录 A.3）、革兰氏染色液、瑞氏染色液、生化鉴定管、细菌培养皿。 仪器 高压灭菌锅、恒温培养箱 、光学显微镜 、生物安全柜、组织匀浆器或研磨器 。 样品处理 7.3.1 将6.2.1中鼻拭子、咽拭子中的棉签反复挤压后取出，将鼻拭子液、咽拭子液分装到 2 mL灭菌 的冻存管中。贴标签于 -80 ℃冰箱保存。 7.3.2 将组织样品分解成 2×2×3 cm大小组织块，然后用无菌剪刀剪碎后，加入 5 mL保存液，研磨 成组织悬液，分装到 2 mL灭菌的冻存管中。贴标签于 -80 ℃冰箱保存。 细菌分离 7.4.1 在无菌条件下，将按一定比例稀释的鼻拭子液、咽拭子液或发病牛羊的肺组织材料接种 TSB培 养基中，置恒温摇床 37 ℃、120 r/min 培养12 h～16 h后划线接种于绵羊血琼脂平板中， 37 ℃培养 24 h，使之形成菌落，以供纯化鉴定用。 DB15/T 2907 —2023 3 7.4.2 取7.4.1中培养的圆形、光滑、湿润并伴有溶血现象的菌落，在绵羊血琼脂平板上进行划线纯 培养，37 ℃培养24 h后，出现上述菌落（参见附录 B中图B.1）。 染色镜检 7.5.1 革兰氏染色 按照GB/T 14926.43 -2001中3.1进行操作， 可见革兰氏阴性短杆菌或球杆菌 （参见附录 B中图B.2）。 7.5.2 瑞氏染色 取病变组织的新鲜切面制备组织触片或抹片，滴加瑞氏染色 A液3～5滴，固定 1 min；滴加瑞氏染色 B液3～5滴，轻轻晃动玻片，静置染色 3 min～5 min；用蒸馏水冲洗，自然干燥后镜检，可见两极着色 的短杆菌或球杆菌（参见附录 B中图B.3）。 生化鉴定 根据《伯杰细菌鉴定手册》溶血性曼氏杆菌生化鉴定项目，采用相应商品化生化鉴定管进行操作和 判定。溶血性曼氏杆菌可发酵麦芽糖、木糖、甘露醇和山梨醇，不发酵海藻糖，靛基质试验和脲酶试验 阴性。 8 PCR检测 试剂耗材 细菌基因组 DNA提取试剂盒、琼脂糖（电泳级）、 DNA分子量标记 DL2000、阴性对照：灭菌超纯水、 阳性对照：灭活的溶血性曼氏杆菌参考菌株（ CVCC4091 ）或gcp基因的阳性质粒（参见附录 B.4）、PCR 扩增用上、下游引物序列（参见附录 B中表B.1）、1.5 mL 离心管、 0.2 mL PCR 薄壁管或八联 管。 仪器 PCR扩增仪、电泳仪、水平电泳槽 、凝胶成像系统 。 细菌基因组 DNA提取 将7.4.1中增菌培养后菌液或 7.4.2中纯培养菌落用商品化试剂盒进行基因组 DNA提取。提取方法按 试剂盒说明书进行。 PCR扩增 每次进行 PCR扩增时，除检测样品外，均需设置阳性对照和阴性对照。 8.4.1 PCR反应体系： 2×PCR反应预混液 12.5 µL，模板DNA（空白对照用水代替） 2 µL，上下游引物 各0.5 µL，ddH2O补足至25 µL。 8.4.2 PCR反应条件： 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s；30个 循环，72 ℃总延伸 10 min。 PCR产物电泳 用1×TAE电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶。取 5 µL PCR产物分别加入样品孔，同时在一加样孔中加 入DNA分子量标准（ DL2000），以5 V/cm恒压电泳， 30 min后采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。 DB15/T 2907 —2023 4 PCR结果判定 8.6.1 阳性对照出现一条 227 bp大小的条带，且阴性对照不出现条带。 8.6.2 在满足8.6.1的条件下，被检样品的 PCR产物经电泳后出现一条 227 bp的条带判定为核酸阳 性（+）；被检样品的 PCR产物经电泳后不出现 227 bp的条带判定为核酸阴性（ -）（参见附录 B中图 B.6）。 9 间接ELISA抗体检测 试剂耗材 大肠杆菌表达的溶血性曼氏杆菌 LKTA重组蛋白、辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊二抗、驴抗山羊二 抗、兔抗牛二抗、 Mh阳性血清、 Mh阴性血清、包被缓冲液（配制方法见附录 A.4）、封闭缓冲液（配制 方法见附录 A.5）、洗涤缓冲液（配制方法见附录 A.6）、稀释缓冲液（配制方法见附录 A.7）、TMB显色 液（配制方法见附录 A.8）、终止液（配制方法见附录 A.9）。 仪器 酶标仪、微量振荡器、恒温培养箱、洗板机。 检测步骤 9.3.1 包被酶标板 Mh重组LKTA蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为 0.5 μg/mL，每孔100 µL包被96孔酶标板， 4 ℃包被 16 h。用洗涤缓冲液洗板 5次，每孔 200 µL，每次3 min，洗涤结束后拍干。然后按 200 µL/孔的用量加 入封闭缓冲液， 37 ℃封闭2