ICS65.120 CCSB46 21 辽宁省地方标准 DB21/T3698—2023 饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测 MethodfordeterminationofClostridiumbutyricuminfeeds 2023-02-28发布 2023-03-28实施 辽宁省市场监督管理局  发布 DB21/T3698—2023 I目次 1范围................................................................................1 2规范性引用文件......................................................................1 3术语和定义..........................................................................1 4缩略语..............................................................................1 5稀释液、培养基及试剂................................................................1 6设备和实验器材......................................................................1 7检验程序............................................................................2 8采样................................................................................3 9试样的制备..........................................................................3 10操作步骤...........................................................................3 11确证试验...........................................................................4 12结果计算与报告.....................................................................5 附录A（规范性）培养基和试剂..........................................................7 附录B（资料性）细菌DNA提取..........................................................9 DB21/T3698—2023 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：大连三仪动物药品有限公司、辽宁国托检测有限公司、江苏三仪生物工程有限公 司、大连工业大学、彰武县畜牧业发展服务中心。 本文件主要起草人：江国托、刘艳、单春乔、李娟、刘秋晨、于洪敏、王岩、赵红秋、翟宏旭、田 晶、陈玲、王效禹、宋蕙男、吴怡琦、刘星、冷寒冰。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈。 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。 文件起草单位通讯地址：大连三仪动物药品有限公司，辽宁省大连市甘井子区营城子镇营旭路9号， 联系电话：0411-66886298。 DB21/T3698—2023 1饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测 1范围 本文件规定了饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测方法。 本文件适用于各种饲料添加剂各组分中丁酸梭菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T4789.2食品微生物学检验菌落总数测定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 FTGFluidThioglycollate，液体硫乙醇酸盐 5稀释液、培养基及试剂 5.10.85%灭菌生理盐水。 5.2丁酸梭菌培养基：见附录A中的A.1。 5.3革兰氏染色液：见附录A中的A.2。 5.4细菌生化鉴定试剂盒。 5.5细菌基因组DNA提取试剂盒。 5.6标准菌株：丁酸梭菌CICC10390。 5.7实验室用水:按照GB/T6682进行。 6设备和实验器材 DB21/T3698—2023 26.1恒温培养箱：37℃±1℃。 6.2漩涡震荡器：0～2800rpm。 6.3显微镜：1000倍。 6.4高压灭菌锅：105～134℃。 6.5无菌玻璃或塑料培养皿Φ=90mm。 6.6无菌锥形瓶250mL。 6.7无菌玻璃或塑料涂布棒。 6.8无菌吸管：1mL（具0.1mL刻度）和10mL（具0.5mL刻度）。 6.9微生物鉴定仪。 6.10电子天平：感量为0.1g、0.01g、0.0001g。 6.114℃冰箱。 6.12pH计：精确度0.1。 6.13量筒：250mL。 6.14普通PCR仪。 6.15电泳仪。 6.16凝胶成像仪。 6.17移液器：量程10μL、100μL、1000μL、10000μL。 7检验程序 丁酸梭菌检验程序见图1。 DB21/T3698—2023 3 图1丁酸梭菌检验程序 8采样 实验室样品真实，具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是无 菌器皿。采样后，样品应及时送至微生物检验室进行检测。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。 9试样的制备 按照GB/T20195进行。 10操作步骤 10.1检样制备与稀释 以无菌操作取试样25g(mL)，注入盛有225mL0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中，均质1min～2min 或置振荡器中振荡30min，制成1︰10的初始菌悬液。吸取1︰10的初始菌悬液1mL，加入9mL0.85% 灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1︰100的稀释液。根据样品含菌量，按上述操作顺序做进一步的10 倍系列递增稀释的稀释度。 10.2接种和培养 选择2个～3个适宜稀释度，每个梯度3个平行，用无菌移液器分别吸取0.1mL稀释液，接种到改良 FTG培养基上，pH7.0±0.2。使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面，涂布棒不应接触 平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。将涂布好的平皿盖好，室温中放置15min，使接种物完全被培 养基吸收，倒置于37℃±1℃培养箱中厌氧培养24h±1h。 10.3菌落计数及筛选 DB21/T3698—2023 4培养后，选取菌落数在30个～300个之间的平板计数，若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采 用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表 全皿菌落数。培养后的平板内的培养基颜色由粉色变成淡黄色，典型丁酸梭菌菌落形态呈端圆，白色， 稍凸，不透明，表面菌落稍有不规则。 11确证试验 11.1菌种制备 自平板上挑取单菌落，划线转接培养于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃±1℃严格厌氧培养24h ±1h，从平板上选取至少5个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。 11.2形态观察 自转接平板上挑取典型单菌落，做革兰氏染色镜检。丁酸梭菌为革兰氏阳性菌，显微镜观测菌体呈 梭状，有芽孢，芽孢呈椭圆形，中生或近中生。 11.3生化确认试验 目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一 致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验。 将挑选纯化的单一菌落，用生化鉴定试剂盒或者生化鉴定管或者微生物鉴定仪按说明进行鉴定试验。 丁酸梭菌生化特征见表1。 表1丁酸梭菌生化特征 特征 结果 特征 结果 乳糖 + 蜜二糖 + 水杨苷 + 松三糖 - 木糖 + 棉子糖 + 山梨醇 - 鼠李糖 - 淀粉水解 + 明胶水解 - 注：+：阳性；-：阴性。 11.4PCR确证试验 11.4.1DNA提取 用商用细菌基因组DNA提取试剂盒或常用提取方法（附录B）提取试样DNA，并设置阴性、阳性对照。 11.4.2扩增引物序列 上游引物：F5′-CTTTATTTGGAGTAGCACCT-3′；