ICS 65.020.01 CCS B 05 3301 浙江省杭州市 地方 标准 DB3301/T 1120—2023 三叶青种质资源鉴定技术规程 SSR标记法 2023-02-28发布 2023-03-28实施 杭州市市场监督管理局 发布 DB3301/T 1120 —2023 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 原理 ................................ ................................ ............... 1 5 仪器设备及试剂 ................................ ................................ ..... 1 6 溶液配制 ................................ ................................ ........... 3 7 操作程序 ................................ ................................ ........... 3 8 判定方法 ................................ ................................ ........... 4 附录A（规范性） 溶液配制 ................................ ............................. 6 附录B（资料性） 推荐引物 ................................ ............................. 8 DB3301/T 1120 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 杭州市农业农村局 提出、归口并组织实施 。 本文件起草单位： 杭州市农业科学研究院、杭州市农 业农村事务保障中心。 本文件主要起草人： 严建立、黄雨晴、阮松林、钱丽华、应武、陆秋君、蔡和平。 DB3301/T 1120 —2023 1 三叶青种质资源鉴定技术规程 SSR标记法 1 范围 本文件规定了利用简单重复序列（ Simple sequence repeats, SSR ）标记进行三叶青（ Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg ）不同种质资源鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序 及判 定方法。 本文件适用于三叶青种质资源 SSR指纹数据采集及种质资源鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 —2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 引物 primer 在核酸合成反应时，作为多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的一小段单链脱氧核糖核酸 （Deoxyribonucleic Acid ，DNA）或核糖核酸（ Ribonucleic Acid ，RNA）。 参照种质资源 reference germplasm resource 具有所用 SSR位点上不同等位变异的品种。参照种质资源用于辅助确定送检样品的等位变异，校正 仪器设备的系统误差。 注：本文件选用的参照品种为：三叶青 2012 -1。 4 原理 由于不同三叶青种质资源遗传组成不同，基因组 DNA中简单重复序列（ SSR）的重复次数有差异，从 而使得不同种质资源中的简单重复序列长度存在差异。这种差异可以通过聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ，PCR）扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同种质资源。 5 仪器设备及试剂 一般规定 DB3301/T 1120 —2023 2 本文件所用的试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682 —2008中规定的三 级水。 仪器设备 本方法中所用的仪器设备包括： a) 普通电泳仪 ； b) 垂直电泳槽及配套的制胶附件； c) 水浴锅； d) 水平摇床； e) 高速冷冻离心机（最大离心力不小于 20 000 g ）； f) 电子天平（精度为千分之一）； g) 微量移液器（量程分别为 10 µL、20 µL、100 µL、200 µL、1 000 µL、5 000 µL）； h) pH计； i) 冰箱（4 ℃和-20 ℃）； j) 磁力搅拌器； k) 核酸定量测定仪； l) 微波炉； m) 高压蒸汽灭菌锅； n) 制冰机； o) 组织破碎仪； p) 凝胶成像系统； q) 超纯水仪。 所用试剂 本方法中所用的试剂包括： a) 十六烷基三甲基溴化铵（ Cetyltrimethylammonium Bromide ， CTAB）； b) 三氯甲烷； c) 异戊醇； d) 异丙醇； e) 乙醇； f) 乙二胺四乙酸二钠； g) 三羟甲基氨基甲烷； h) SSR引物； i) DNA标准分子量标记（ marker）； j) 5× PCR预混液 Pre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示剂）； k) 琼脂糖； l) 冰醋酸； m) 氢氧化钠； n) 丙烯酰胺； o) 甲叉双丙烯酰胺； p) 过硫酸铵； q) 四甲基乙二胺； r) 硝酸银； DB3301/T 1120 —2023 3 s) 甲醛； t) 乙二胺四乙酸； u) 硼酸； v) 氯化钠。 6 溶液配制 按照附录 A的规定配制溶液 。 7 操作程序 样品准备 选取三叶青幼嫩叶片，每份样品检测 5张叶片的混合样，并设置三个重复。 DNA提取 DNA提取应按照以下步骤进行： a) 将0.5 g叶片剪碎后放入 2.0 mL离心管，加入 800 µL 经65 ℃预热的十六烷基三甲基溴化 铵 （Cetyltrimethylammonium Bromide , CTAB）缓冲提取液，加入 2粒钢珠，置于组织破碎 仪上研磨充分成匀浆； b) 上述匀浆经 65 ℃水浴 1 h，期间颠倒混匀 2次～3次，取出静置 2 min，而后在离心机中 10 000 g离心 15 min，用移液器小心吸取 500 µL 左右上清液至另一个洁净离心管中，加入 500 µL的三氯甲烷 :异戊醇（体积比为 24:1）溶液，颠倒混匀，置于离心机中 10 000 g 离心 10 min； c) 小心吸取上述所得上清液约 450 µL，加入异丙醇 300 µL，颠倒混匀，在 -20 ℃冰箱中放置 20 min，置于离心机中 10 000 g 离心15 min； d) 倒掉上述上清液，依次加 500 µL 75%和 100%乙醇各洗一次，晾干后，加入 100 µL 三羟甲基 氨基甲烷 -乙二胺四乙酸（ Tris-EDTA buffer solution ，TE）水溶液溶解，经核酸定量测定仪 测定DNA浓度，用超纯水将 DNA稀释至约 100 ng/ µL，以备后续 PCR扩增，-20℃保存。 PCR扩增 7.3.1 引物选择 宜选择附录 B中引物进行扩增。 7.3.2 反应体系 SSR-PCR扩增体系为 15 µL，包括3 µL Pre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示剂 ）、1 µL模板 （含75 ng～100 ng上述提取所得 DNA）、0.6 µL正向引物 （ 0.4 μmol/L）、0.6 µL反向引物 （ 0.4 μmol/L） 和超纯水 9.8 µL。 7.3.3 PCR反应程序 PCR反应程序如下： a) 94 ℃预变性5 min； b) 94 ℃变性1 min； DB3301/T 1120 —2023 4 c) 60 ℃退火45 s； d) 72 ℃延伸30 s～60