ICS65.020.20 CCSB05DB1308 承德市地方标准 DB1308/T321—2023 春季萝卜游离小孢子培养技术规程 2023-02-25发布 2023-03-01实施 承德市市场监督管理局发布 DB1308/T321—2023 I前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由承德市农业农村局归口。 本文件起草单位:承德市蔬菜技术推广站、围场满族蒙古族自治县蔬菜环保站、兴隆县工商业联合 会。 本文件主要起草人：王玉宏、郑鹏婧、姜红玉、姜涛、李兵、刘博、王春红、刘斯超、唐丽丽、卞 颖。 DB1308/T321—2023 1春季萝卜游离小孢子培养技术规程 1范围 本文件规定了萝卜游离小孢子培养技术的术语和定义、培养条件、操作流程、操作方法以及档案管 理等内容。 本文件适用于春季萝卜游离小孢子培养，十字花科蔬菜游离小孢子的培养可参照执行。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 3.1 游离小孢子 不形成配子的游离状的单核细胞。 3.2 游离小孢子培养 在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而是像体细胞一样进行分裂、分化、最 终发育成完整植株。 4培养条件 4.1实验室 环境整洁，干净卫生，有温度调节设备，室内温度控制在20℃～27℃。 4.2试剂或材料 培养用水符合GB/T6682中规定的三级水，除非另有规定，在培养过程中仅使用分析纯试剂，试 剂或材料包括： a)B5培养基基盐干粉（含维生素）； b)NLN培养基基盐干粉（不含维生素）； c)肌醇，纯度≥90.0%； d)蔗糖； e)琼脂； f)萘乙酸； DB1308/T321—2023 2g)还原型谷胱甘肽，纯度≥99%； h)L-谷氨酰胺，纯度≥99%； i)L-丝氨酸，纯度≥99%； j)一水吗啉乙磺酸，纯度>99%； k)乙醇溶液，75%； l)次氯酸钠溶液，5%； m)硝酸钙溶液，25%； n)秋水仙碱溶液，0.3%； o)活性炭悬浮液，1g/100ml； p)100×维生素溶液：甘氨酸0.1g、烟酸0.25g、维生素B60.025g、维生素B10.025g、叶酸0.025g、 D-生物素0.0025g，加蒸馏水定容到500ml。 4.3仪器设备与器具 4.3.1仪器设备 a)超净工作台； b)立式压力蒸汽灭菌器：压力0.25MPa，温度139℃； c)生化培养箱； d)酸碱度测试仪； e)电子天平：最大称量：220g，实际分度值：0.0001g； f)离心机：1000r/min或以上； g)隔膜真空泵：真空度200mbar； h)longer-pump蠕动泵：转速1r～300r； i)流式细胞仪。 4.3.2器具 a)烧杯：50ml； b)三角瓶：100ml； c)大烧杯：1L； d)研钵：6cm； e)试管：10ml； f)古式漏斗：3.5cm×12cm； g)酒精灯：400ml； h)一次性培养皿：60mm； i)石蜡封口膜：4cm×125cm； j)眼科镊子：10cm； k)手术刀；3号； l)长柄镊子：15cm。 5操作流程 培养基配置→超净工作台操作→环境培养→小孢子植株移栽→留种。 DB1308/T321—2023 36操作方法 6.1培养基配置 6.1.1B5液体培养基 称取B5培养基基盐干粉（含维生素）3.164g，加入0.1g肌醇和130g蔗糖，加蒸馏水定容到1L， 将培养基pH值调至5.8，分装于100ml三角瓶中，使用蒸汽灭菌器120℃湿热灭菌20min，灭菌后取 出4℃保存。 6.1.2B5固体培养基 称取B5培养基基盐干粉（含维生素）3.164g，加入肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂7.5g，加蒸馏水 定容到1L，将培养基pH值调至5.8，分装于100ml三角瓶中，每瓶40ml，使用蒸汽灭菌器120℃湿 热灭菌20min，灭菌后取出，待冷却凝固后4℃保存。 6.1.3改良1/2NLN培养基 称取NLN培养基基盐干粉（不含维生素）0.387g，加入硝酸钙溶液2ml、100×维生素液10ml、 肌醇0.1g、还原型谷胱甘肽0.03g、L-谷氨酰胺0.8g、L-丝氨酸0.1g、蔗糖130g和一水吗啉乙磺 酸0.6396g，使用大烧杯加蒸馏水定容到1L，将培养基pH值调到5.8，使用隔膜真空泵，将培养基经 0.2μm水系微孔过滤膜反复过滤三次，之后在超净工作台中，使用longer-pump蠕动泵，将过滤后的 培养基再经0.22μm过滤器过滤到已经灭菌的三角瓶中，锡泊纸封口，4℃保存。 6.2超净工作台操作 6.2.1设备消毒 将50ml烧杯、研钵、10ml试管、古式漏斗用锡箔纸包扎好，蒸汽灭菌器120℃灭菌20min。将 超净工作台内用75%乙醇全面擦拭一遍。将离心机、酒精灯、50ml烧杯、10ml试管、研钵、古式漏 斗、乙醇、次氯酸钠、瓶装无菌水、B5液体培养基、改良1/2NLN培养基、60mm一次性培养皿、石蜡封 口膜等必需品放入超净工作台，紫外线灭菌30min。 6.2.2准备花蕾 待萝卜抽苔后，选取花序上第一朵花开放后的主枝、一级分枝、二级分枝和三级分枝上的萝卜花蕾， 经4℃低温处理1d～3d，备用。制备时，选取长度2.5mm～3mm的完整花蕾，去除残次的和长度不 符的花蕾。将选取的花蕾放入烧杯中，清水冲洗30min，倒出水将花蕾放入超净工作台备用。 6.2.3花蕾消毒 先将冲洗干净的花蕾用乙醇表面消毒30s，期间摇动烧杯，烧杯间不要碰撞。然后使用次氯酸钠 深度消毒15min，期间多次摇动烧杯，烧杯间不要碰撞，每次摇动结束后，要用乙醇擦拭台面。最后， 使用无菌水清洗5min，期间摇动烧杯，充分清洗，此步骤重复操作3次，烧杯间不要碰撞，完成清洗 后用乙醇擦拭台面。 6.2.4研磨花蕾 将消毒过的花蕾放于研钵中，倒入B5液体培养基，液面高出花蕾即可，轻敲研钵，使所有花蕾破 裂，花粉释放出即可，加入B5液体培养基定容到10ml。 DB1308/T321—2023 46.2.5花蕾液过滤 将研磨好的10ml花蕾液倒入古式漏斗，经400目纱网过滤后，移至10ml离心管，使用离心机 1000r/min离心3min，倒掉上清液，倒入1mlB5液体培养基，将沉淀摇起，定容到10ml，经3次反复 操作后，倒掉上清液，得到纯净的花粉母细胞液。 6.2.6分装 在纯净的花粉母细胞液中加入1ml改良1/2NLN培养基，将沉淀摇起垂悬，定容到10ml，分装到 10个60mm的培养皿中，每皿加入5ml改良1/2NLN培养基稀释，并添加活性炭悬浮液1ml，最后用 石蜡封口膜封口，培养皿表面做好标记。 6.2.7超净工作台注意事项 超净工作台使用过程中，要求双手不能离开台内，操作中双手要低于物品、水平活动，每一步操作 结束后都要用乙醇擦拭台面消毒。 6.3环境培养 6.3.1现胚培养 将分装好的培养皿放入生化培养箱中，33℃避光热激24h，后调至25℃避光培养2～3周，即可现 胚。 6.3.2再生培养 在超净工作台环境下，用眼科镊子将子叶型胚接种至B5固体培养基上。接种后在25℃自然光下培 养，三周后子叶型胚发育成幼苗。 6.3.3复壮培养 在超净工作台环境下，取出幼苗，手术刀去除叶片和根区，长柄镊子将剩余组织接种到新的B5固 体培养基中，在25℃自然光下进行培养，之后继代培养3～5代，待苗茎粗达到0.1cm～0.2cm，萌发出 2叶1心，具有一定抗性且生根后，进行炼苗。如根系生长不完善，可在培养基中加入适量萘乙酸，促进 根系长成。 6.4小孢子植株移栽 打开瓶口锻炼5d～7d，之后将苗取出洗净根部琼脂，移植于营养杯中，精心管理，在4℃～5℃低 温环境下10d～20d通过春化，3周后统计成活率，当苗长到4叶1心时达到成苗标准，即可移栽定植。 6.5留种 定植后，用流式细胞仪或花粉母细胞染色体计数法检测植株倍性，单倍体植株用秋水仙碱溶液刺激 侧芽或根部进行加倍，加倍成功后和双单倍体及多倍体分别进行自交授粉留种。 7档案管理 根据小孢子出胚情况、成苗情况以及授粉情况进行统计留档。档案科目包括编号、品种名、类型、 出胚总皿数、出胚总数、每皿出胚数、畸形胚数、处理方法、培养日期、出胚时间、成苗数、留种克数。