ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 42364—2023 传染性无乳症诊断技术 Diagnostic techniques for contagious agalactia 2023-10-01实施 2023-07-01发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T42364—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本文件主要起草人：储岳峰、颜新敏、高鹏程、陈胜利、郑福英、郝华芳、付磊、李学瑞、宫晓炜、陈启伟 许健、宋银娟。 1 GB/T42364—2023 引言 （WorldOrganizationforAnimalHealth，WOAH)法定报告的羊病之一，主要表现为乳腺炎、关节炎和 角膜结膜炎，有些病例会出现肺炎、败血症，母羊偶见流产。 无乳支原体（Mycoplasmaagalactiae，Ma）是CA的主要病原，但丝状支原体山羊亚种（Mycoplas- mamycoidessubsp.capri，Mmc）、山羊支原体山羊亚种（Mycoplasmacapricolumsubsp. capricolum，Mcc）和腐败支原体（Mycoplasmaputrefaciens，Mpf)也是该病的病原。 本文件的制定参考了WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2022），并结合了我国相关技 术研究新成果。 Ⅱ GB/T42364—2023 传染性无乳症诊断技术 1范围 本文件规定了传染性无乳症的临床诊断以及样品采集、运输和保存，描述了病原分离与鉴定、普通 PCR方法、荧光PCR方法等实验室诊断方法。 本文件适用于绵羊和山羊传染性无乳症的诊断。 2规范性引用文件 2 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CA：传染性无乳症（contagiousagalactia） Ct值：循环阈值（cyclethresholdvalue） EDTA·Na2:乙二胺四乙酸二钠盐(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) MTA：改良Thiaucourt's琼脂(modifiedThiaucourt'sagar) MTB:改良Thiaucourt's肉汤（modified Thiaucourt'sbroth) Ma：无乳支原体（Mycoplasmaagalactiae） Mcc：山羊支原体山羊亚种（Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum） Mmc：丝状支原体山羊亚种（Mycoplasmamycoidessubsp.capri) Mpf：腐败支原体（Mycoplasmaputrefaciens） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） PPLO：类胸膜肺炎微生物（pleuropneumonialikeorganisms） Taq 酶:TaqDNA 聚合酶(Taq DNA polymerase) 5 临床诊断 5.1 流行特点 5.1.1 易感动物 各种年龄、性别、品种的羊均易感，山羊较绵羊易感。泌乳期的奶山羊多发。 5.1.2 传染源 病羊和无症状带菌羊是本病主要的传染源，脓汁、乳汁、眼和鼻的分泌物、粪尿等可长期带菌。 1 GB/T42364—2023 5.1.3传播途径 可经消化道、呼吸道、眼结膜、乳腺或创伤传染，还可经垫草或挤奶工人接触传播。 5.2 临床症状 5.2.1概述 主要表现为乳房炎型、关节炎型和角膜结膜炎型3种类型，常见混合性临床表现。有时伴有肺炎和 败血症，偶见怀孕母羊发生流产或死胎 5.2.2乳房炎型 初见乳房局部轻微肿大，触诊疼痛，有的淋巴结肿大，乳头基部有硬结节。随着病程发展，泌乳量逐 渐减少，乳汗变稠，含有白色絮片或凝块，继而流出带有凝块的水样液体。后期乳腺逐渐萎缩，泌乳停 止。部分病例会伴发关节炎和角膜结膜炎，偶见肺炎和母羊流产。 5.2.3关节炎型 病程2周～8周或更长，多见于腕关节及关节，其他关节较少。初期跛行，关节无明显变化。病 情加重可见关节肿胀及周围皮下水肿。后期患病关节逐渐僵硬，不能站立。羔羊可发生肺炎和败血 症,有的死亡。 5.2.4角膜结膜炎型 初期惧光、流泪、结膜红肿、分泌黏液，角膜逐渐浑浊增厚、变成白。白消失后，多形成溃疡，溃 疡癜痕化后形成角膜白斑。随着病程发展，白斑消失，角膜逐渐透明。严重时角膜组织可发生崩解，甚 至晶状体脱出。 5.3剖检病变 5.3.1乳房炎型 乳腺断面呈多室性腔状，腔内充满凝乳样物质，呈绿色或白色。乳房实质内有豌豆大小的结节分 布，挤压时流出干酪样物质。可见间质性乳房炎和卡他性输乳管炎。 5.3.2关节炎型 腕关节和关节的关节囊水肿，结缔组织增生导致关节囊壁增厚；关节腔内纤维素性渗出，滑液中 有纤维素性团块；关节面充血、糜烂。部分病例可见肺炎、胸膜炎 5.3.3角膜结膜炎型 角膜乳白色，前房液中可发现半透明胶块，严重时角膜水肿，中央出现白色小病灶或逐渐转变为溃 疡；更严重时角膜穿孔，全眼球炎症。 5.4结果判定 符合5.1中流行特点之一、5.2中临床症状之一以及5.3中剖检病变之一的发病羊，可判定为疑似 传染性无乳症。 2 GB/T42364—2023 6 样品采集、运输与保存 6.1 材料准备 6.1.1 解剖刀、剪子、镊子、样品容器、一次性注射器和针头等均为无菌器械。 6.1.2 低温台式离心机。 6.1.3普通温箱。 6.1.4 普通冰箱。 6.2 2组织样品 活羊可选取乳汁、关节液、鼻分泌物、鼻咽拭子和结膜拭子作为样品。耳道拭子和急性发病期羊的 抗凝血可作为备选样品。尸户体解剖时，可采集乳腺和淋巴结、关节液、肺组织（在患病组织和健康组织的 交界处）及胸膜/心包液的样品。采集后的样品应分别放入灭菌容器保存，置于冰上冷链运输，尽快送至 实验室检测或置一70℃以下冻存。 6.3血清样品 无菌采集羊颈静脉血，室温先倾斜30℃下静置2h～4h，待凝血析出血清后，3500r/min～ 4000r/min室温离心5min，分离血清，置于冰上冷链运输，尽快送至实验室检测或置一20℃冻存。 病原分离与鉴定 7.1 材料准备 7.1.1 器材 7.1.1.1 生化培养箱。 7.1.1.2 CO2培养箱。 7.1.1.3 组织匀浆设备。 7.1.1.4 低温台式高速离心机。 7.1.1.5 生物安全柜。 7.1.1.6 光学显微镜。 7.1.1.7 微量可调移液器（100μL～1000μL）及配套吸头。 7.1.1.8 灭菌剪刀，0.45μm微孔滤膜。 7.1.2 试剂 7.1.2.1 MTB培养基，按照附录A中A.1的方法配制。 7.1.2.2 MTA培养基，按照A.2的方法配制。 7.2样品处理 7.2.1拭子置于1mLMTB培养基中，充分捻动，挤干后弃去拭子，作为接种材料。 7.2.2组织样品用剪刀剪碎，每0.1g加MTB培养基0.9mL，研磨匀浆，作为接种材料。 7.2.3 液体样品（乳汁、关节液、胸膜/心包液、抗凝血液等）直接用作接种材料。 3 GB/T42364—2023 7.3样品接种 7.3.1样品稀释：取接种材料0.5mL加至4.5mLMTB培养基中，标记为10-1管，连续做10倍系列稀 释至10-3管。 7.3.2接种：从上述3个梯度稀释样品中各取0.5mL分别接种至4.5mLMTB中，取0.2mL分别接 7.4克隆纯化 7.4.1接种物连续观察7d，每日检查支原体生长情况： 一若MTA培养基上出现煎蛋样菌落，疑似支原体生长时，应按照7.4.4进行克隆纯化； 一若MTB培养基颜色变黄、轻微浑浊，应取0.2mL接种至MTA培养基继续培养，待出现煎蛋 样菌落时，按照7.4.4进行克隆纯化。 7.4.2若7d后MTA和MTB培养基均未见疑似支原体生长： 一MTA培养基继续培养至21d，若仍无疑似支原体生长，则弃之； 一从MTB培养物分别取0.5mL接种至新的4.5mLMTB中进行盲传；按照7.4.1进行观察处 理：若仍未生长，再盲传一次按照7.4.1观察处理。 7.4.3培养过程中，如果MTB培养液出现细菌污染，则取培养液用孔径0.45μm微孔滤膜过滤后，再 取滤过液0.5mL按照7.3.1接种观察。 7.4.4若MTA培养基上出现煎蛋样菌落，则切取单个菌落（含琼脂块），倒置在一个新的MTA培养基 的琼脂表面，轻轻移动琼脂块进行克隆纯化；连续2次克隆纯化后，对单个菌落培养物按照第8章进行 鉴定。 7.5结果判定 获得克隆纯化的支原体并经普通PCR方法检测为4种支原体任一阳性，判为病原分离鉴定阳性 8普通PCR方法 8.1材料准备 8.1.1 仪器与器材 8.1.1.1 超净工作台。 8.1.1.2 PCR扩增仪。 8.1.1.3 电泳仪和电泳槽。 8.1.1.4凝胶成像系统或紫外检测仪。 8.1.1.5 5微量可调移液器（0.5μL～10μ、10μ～100L20μL～200μL和100μL～1000μL）及配 套滤芯吸头。 8.1.2试剂 8.1.2.1 灭菌生理盐水（0.85%氯化钠溶液）。 8.1.2.2 市售动物组织基因组DNA提取试剂盒