ICS 65.120 CCS B 46 37 山东省 地方标准 DB37/T 4600.3—2023 饲料中违禁物质检测 第3部分： 大环内酯 类 Determination of forbidden substances in feeds —Part 3: Macrolides 2023 - 04 - 16发布 2023 - 05 - 16实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4600.3 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是 DB37/T 4600《饲料中违禁物质检测》的第 3部分。DB37/T 4600已经发布了以下部分： ——第3部分：大环内酯类。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 DB37/T 4600.3 —2023 II 引言 近年来， 作为饲料添加剂的大环内酯类药物成为我国乃至世界范围内需求量和销售速度增长最快的 抗生素之一。但长期使用这类抗生素不仅在动物体内造成残留，还会随粪便排出体外进而污染环境，导 致微生物菌群的失调和革兰氏阳性菌耐药性的增加，对动物及人类健康产生危害。目前还没有针对饲料 中大环内酯类药物残留检测的方法标准。因此，研究饲料中红霉素、罗红霉素、竹桃霉素、泰乐菌素、 替米考星、交沙霉素留限量及其检测技术，对于控制动物源性食品药物残留，保证食品质量安全和消直 接费者食用安全有着重要的意义。 DB37/T 4600.3 —2023 1 饲料中违禁物质检测 第3部分：大环内酯类 1 范围 本文件规定了饲料中罗红霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙毒素、竹桃毒素、红霉素 6种大环内酯 类药物测定的高效液相色谱 -串联质谱法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料中罗红霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙毒素、竹桃毒素、红霉 素6种大环内酯类药物的测定。 本方法检出限为 5 μg/kg，定量限为 10 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 用乙腈提取样品中大环内酯类药物，固相萃取柱净化，液相色谱 -串联质谱测定，外标法定量。 5 试剂或材料 除非另有说明，在分析中所用试剂均为分析纯和符合 GB/T 6682 规定的一级水。 乙腈（CH3CN，75-05-8）：色谱纯。 5.1 甲酸（HCOOH，64-18-6）：色谱纯。 5.2 甲醇（CH3OH，67-56-1）：色谱纯。 5.3 0.1 mol/L氢氧化钠溶液。 5.4 称取4.0 g氢氧化钠，并用水稀释至 1 L，摇匀。 磷酸盐缓冲溶液： 0.1 mol/L。 5.5 称取6.0 g磷酸氢二钠溶解于 450 mL水中，用氢氧化钠调节 pH=8，用水定容至 500 mL，摇匀。 0.1 %甲酸溶液。 5.6 准确吸取甲酸（ 5.2）1 mL加水至1 000 mL，摇匀。 0.1 %甲酸-乙腈溶液。 5.7 0.1 %甲酸溶液（ 5.6）+乙腈（5.1）=50+50，摇匀。 标准储备溶液： 1.0 mg/mL。 5.8 DB37/T 4600.3 —2023 2 准确称取罗红霉素（ CAS编号：80214-83-1，纯度≥ 95 %）、替米考星（ CAS编号：108050-54-0， 纯度≥95 %）、泰乐菌素（ CAS编号：1401-69-0，纯度≥ 95 %）、交沙霉素（ CAS编号：16846-24-5，纯 度≥95 %）、竹桃霉素（ CAS编号：7060-74-4，纯度≥ 95 %）、红霉素（ CAS编号：114-07-8，纯度≥ 95 %） 标准品各约 10 mg（精确至 0.01 mg），分别置于 10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容。 于-18 ℃以下保存，有效期为 3个月。 标准中间溶液。 5.9 准确吸取适量标准储备溶液（ 5.8）， 用乙腈配制成浓度为 10 µg/mL的标准中间溶液。 4 ℃保存，有效期为 1个月。 标准工作液。 5.10 用空白样品提取液分别配成浓度为 1 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL的标准工作 溶液，现用现配。 聚苯乙烯二乙烯基苯吡咯烷酮填料固相萃取柱或者相当者： 60 mg/3 mL。 5.11 6 仪器设备 高效液相色谱 -串联质谱仪：三重四级杆质 谱检测器，配有电喷雾离子源（ ESI）。 6.1 分析天平：感量分别为 0.01 mg和0.01 g。 6.2 离心机：转速不低于 8 000 r/min。 6.3 固相萃取装置。 6.4 氮吹仪。 6.5 涡旋振荡器。 6.6 微孔滤膜： 0.22 μm，有机系。 6.7 7 样品 按照GB/T 20195 的规定，选取有代表性的样品，粉碎使之完全通过 0.42 mm孔径的分析筛，装入磨 口瓶，密封保存备用。 8 试验步骤 提取 8.1 平行做两份试验， 准确称取 2 g试样 （精确至 0.01 g） 置于50 mL离心管中， 准确加入 10 mL乙腈 （5.1）， 涡旋， 超声提取 10 min，于8 000 r/min离心10 min。 准确移取上清液 2 mL， 加入10 mL磷酸盐缓冲溶液 （ 5.5）， 涡旋混匀，备用。 净化 8.2 固相萃取柱（ 5.11）预先依次用 3 mL甲醇（5.3），3 mL水，3 mL磷酸盐缓冲液（ 5.5）活化。移取 提取液（ 8.1）过固相萃取柱，用 3 mL水淋洗，弃去全部流出液。用 3 mL甲醇（5.3）洗脱，收集洗脱液。 将洗脱液 50 ℃氮吹浓缩至近干，准确加入 1.0 mL甲酸水-乙腈溶液（ 5.7）溶解，涡旋混匀，用 0.22 μm 滤膜过滤后，待测。 9 测定 DB37/T 4600.3 —2023 3 液相色谱参考条件 9.1 色谱柱： C18柱，2.1 mm×50 mm，1.7 μm或相当者。 柱温：35 ℃。 进样量： 1.0 μL。 流动相、流速及梯度洗脱条件见表 1。 表1 流动相、流速及梯度洗脱参考条件 时间 min 流速 mL/min 甲酸溶液 % 乙腈 % 0 0.3 80 20 4.0 0.3 20 80 5.0 0.3 20 80 5.1 0.3 80 20 6.0 0.3 80 20 质谱参考条件 9.2 电离模式：电喷雾正离子。 毛细管电压： 3.0 kV。 离子源温度： 150 ℃。 脱溶剂温度： 350 ℃。 脱溶剂氮气流速： 800 L/h。 检测方式：多反应监测（ MRM）。 定性、定量离子参考条件见表 2。 表2 定性、定量离子对 药物名称 定量离子对 m/z 定性离子 对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 替米考星 869.5＞174.4 869.5＞174.4 869.5＞156.6 35 35 50 40 泰乐菌素 916.5＞174.2 916.5＞174.2 916.5＞772.7 20 20 15 15 红霉素 734.6＞158.5 734.6＞158.5 734.6＞576.5 18 18 13 17 罗红霉素 837.6＞679.6 837.6＞679.6 837.6＞158.4 20 20 14 22 交沙霉素 828.8＞174.3 828.8＞174.3 828.8＞229.3 30 30 14 14 竹桃霉素 688.6＞158.4 688.6＞158.4 688.6＞544.6 25 25 13 19 定性测定 9.3 DB37/T 4600.3 —2023 4 在相同试验条件下， 样品中待测物质保留时间与标准溶液保留时间的偏差不超过标准溶液保留时间 的±2.5 %，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度 进行比较，偏差不超过表 3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。 表3 定性离子确证时相对离子丰度的最大允许偏差（ %） 相对离子丰度 ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 定量测定 9.4 在仪器最佳条件下，混合标准工作液与试样交替进样，采用基质匹配标准溶液校正，外标法定量。 样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，当样品的上机液浓度超过线性范围时，需根 据测定浓度，稀释后进行重新测定。上述色谱和质谱条件下，大环内酯类标准溶液的多反应监测色谱图 见附录A。 10 数据处理 用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照