ICS65.020.30 CCSB45 12 天津市地方标准 DB12/T1190—2023 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鉴别技术 规程 CodeofpracticeforidentificationofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilk 2023-04-07发布 2023-05-07实施 天津市市场监督管理委员会  发布 DB12/T1190—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。 本文件起草单位：天津市农业科学院。 本文件主要起草人：马毅、谭冬飞、陈丽丽、赵康、张漫、芦娜、王丽学。 DB12/T1190—2023 1牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鉴别技术规程 1范围 本文件规定了的牛奶中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测原理、主要试剂配制、主要仪器设备、质谱检 测及数据处理参数、检测方法、结果判定、废弃物的处理和检测过程中防止交叉污染的措施。 本文件适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2 β-酪蛋白由209个氨基酸组成，其一级序列中的第67位氨基酸的种类为脯氨酸（Proline,P）时， 称为A2型β-酪蛋白。 3.2 A2奶A2milk 所含β-酪蛋白为A2型的牛奶。 3.3 质荷比mass-to-chargeratio 离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。 4检测原理 β-酪蛋白变体型对应的氨基酸突变位点为第67位组氨酸（Histidine,H）突变为脯氨酸（Proline, P），不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据差异肽段的分子量及质荷比差异将样 品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同突变体型β-酪蛋白 检测的目的。 5试剂配制 实验所用水为符合GB/T6682规定的一级水；高压灭菌条件为121℃，1.034*105Pa压力，蒸汽灭菌 20min。试剂配制如下： DB12/T1190—2023 2——样品裂解液：将480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1L； ——10%SDS（十二烷基硫酸钠）：将10gSDS粉末溶于80mL蒸馏水中，加热至68℃助溶，用 HCl调pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的滤膜过滤，高压灭菌； ——30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60mL的蒸馏水中， 充分溶解后，定容至100mL； ——1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）：将181.65gTris溶于800mL水中，加浓盐酸调pH至8.8， 容至1000mL； ——1mol/LTris-HCl（pH=6.8）：将121.1gTris溶于800mL水中，加浓盐酸调pH至6.8，容 至1000mL； ——10%过硫酸铵：将10g过硫酸铵粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL； ——考马斯亮蓝染色液：量取甲醇45mL，蒸馏水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考马斯亮蓝 R-250； ——考染脱色液：50mL碳酸氢铵/乙腈=1：1； ——1μg/μL胰蛋白酶：将100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mmol/L乙酸中，-70℃储存； ——25mmol/L碳酸氢铵：将2.0碳酸氢铵溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1L。 6仪器设备 6.1单道可调移液器 0.25～2.5μl、1～10μl、2～20μl、5～50μl、10～100μl、20～200μl、100～1000μl。 6.210K超滤管 超滤管截留蛋白分子量：30～90KDa。 6.3离心机 最高转速12000r/min，最大容量24×1.5mL。 6.4电子天平 万分之一精度。 6.5凝胶成像分析系统 有胶像素1280×1024，检测灵敏度DNA≥0.05ng。 6.6稳压稳流电泳仪 输出电压0～600V，输出电流0～100mA。 6.7垂直电泳槽 外形尺寸15cm×12cm×13cm，凝胶板面积10cm×10cm。 6.8高压灭菌锅 使用温度范围45～135℃，最高使用压力0.255Mpa。 6.9自动双重纯水蒸馏器 DB12/T1190—2023 3功率3000W，出水量2500mL/h。 6.10微波炉 功率700W，容积20L。 6.11冰箱 4℃，-20℃。 6.12电热恒温水浴锅 RT+5～70℃ 7质谱检测及数据处理参数 应按照附录A执行。 8检测方法 8.1样本采集 每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶和末乳）50mL，充分混匀后，-80℃保存。 8.2蛋白提取 8.2.1从-80℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50μL。 8.2.2向上述样品中加入500μL裂解液[8mol/L尿素，30mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）]。 冰上裂解10min。4℃，20000g，离心30min。取上清，避免吸到油脂。 8.2.3加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10mmol/L。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM） 至终浓度55mmol/L，暗室静置1h。 8.2.4使用考马斯蓝染色法（Bradford法）对蛋白质进行定量。 8.2.5对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析（如附录C.1）。 8.3蛋白质的消化 8.3.1取8.2.5中蛋白20μg，加入到10K超滤管中，14000g，4℃，离心40min，弃废液。 8.3.2加入200μL的25mmol/L碳酸氢铵（NH4HCO3），14000g，4℃，离心40min，弃废液。 8.3.3重复8.3.2步骤两遍。 8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。离心 收集消化后的肽段。 8.3.5真空抽干消化后的肽段。 8.3.60.1%甲酸（FA）复溶肽段。 8.4质谱鉴定 8.4.1将8.3.5提取的酪蛋白肽段进行上机检测。使用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱仪对获得 的酪蛋白肽段进行分离并检测，液相及质谱检测参数见表1～表3。 DB12/T1190—2023 4表1液相色谱柱参数 项目 参数 色谱柱 WatersXbridgeBEH300C18(100mm×2.1mm3.5μm) 流动相A 0.2%甲酸-水(v/v) 流动相B 0.2%甲酸乙腈(v/v) 柱温箱 40℃ 流速 0.3mL/min 进样体积 5μL 表2液相色谱流动相洗脱梯度 时间（分） B液比例 0 2% 2 2% 5 10% 20 40% 22 95% 25 95% 25.1 2% 28 2% 表3质谱检测-离子源参数 参数名称 参数值 离子模式 正离子模式 母离子扫描范围 50-2000m/z 二级分辨率 30000 离子源温度 500 离子化电压 5500V 采集模式 数据依赖型采集(Independentdataacquired,IDA) 碰撞能量 35±15V 气帘气 氮气35psi 雾化气 氮气50psi 辅助加热气 氮气50psi 8.4.2对原始数据进行过滤、峰提取和筛选，确定特征性肽段。质谱扫描完毕，得到质谱原始文件， 将质谱原始数据文件导入后，进行一级色谱峰的滤噪、峰提取、筛选出含有p.67位氨基酸的特征肽段， DB12/T1190—2023 5筛选参数见表4。 表4质谱峰筛选参数 参数名称 实验选项 母离子质量范围 50-2000Da 质量偏差宽度 0.02Da 保留时间偏差0.2min 信噪比S/N域值 3 8.4.3筛选后的差异性肽段用Proteinpilot软件进行差异肽段序列的比对和鉴定，检索参数见表5。 表5鉴定检索参数 参数名称 参数条件 烷基化试剂 碘乙酰胺 可变修饰 Oxidation(M),Gln→Pyro-Glu(N-termQ) Phospho(ST),Ser→Arg(S),Ser→Lys(S),Arg→Cys(R),Gln→Glu(Q), Glu→Lys(E),Met→Leu(M),Pro→His(P),Pro→Leu(P),His→Gln(H) 质量偏差 0.35Da 最大允许漏切数 1 酶的类型(Enzyme) Trypsin 置信度(FDR) >95% 数据库(Database) https://www.uniprot.org/_Bostaurus 9结果判定 9.1SDS-PAGE鉴定 将从样品中提取的蛋白质进行SDS-PAGE分离鉴定，检测蛋白条带是否清晰无降解。条带清晰，表示 可用于后续检测，否则重新取样鉴定，检测结果见图1。 DB12/T1190—2023 6 图1SDS-PAGE检测结果（红框内条带为β-酪蛋白） 9.2A2型β-酪蛋白的判定 根据质谱鉴定结果，当待测样品的中p.67H氨基酸突变为p.67P（如图2），检测结果表述为“A2 奶”。 注：虚线框内为不同变体型β-酪蛋白的突变位点。 图2A2型β-酪蛋白对应的氨