ICS65.020.30 CCSB40 团体标准 T/DALN029-2023 生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量检测 StaphyiococcusforQuantitativetestinginFreshmilk   2023-05-04发布 2023-05-19实施 辽宁省奶业协会协会发布 全国团体标准信息平台 T/DALN029-2023 前  言 本文件参照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 给出的规则起草。 本标准起草单位：辽宁省奶业协会、辽宁奉牧联合奶业有限公司、沈阳师范大学食品学 院、锦州益多乐乳业有限公司、大连三寰乳业有限公司、鞍钢实业集团乳业有限公司、丹东 升泰乳业有限公司、铁岭市大牛乳品有限公司、本溪木兰花乳业有限责任公司。 本标准主要起草人：佟艳、李润国、朱旻鹏、杨明洁、贾丽娇、王南南、白春生、唐 莹、高忠梅、白子金、高林、杜宏伟、郑晓明、王长霞 本标准由辽宁省奶业协会提出并归口。 本标准版权归辽宁省奶业协会。 本标准首次发布。 全国团体标准信息平台 T/DALN029-2023 生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量检测 1范围 本标准规定了生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量检测的术语与定义及仪器设备和试剂、鉴定 金黄色葡萄球菌引物与探针说明、实验方法、结果判定、人员防护、注意事项等。 本标准适用于生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的 引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有 的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范 NY/T541动物疫病实验室检验采样方法 YY/T1173聚合酶链反应分析仪 JJF1527聚合酶链反应分析仪校准规范 3术语和定义 下列术语及定义适合于本文件 3.1金黄色葡萄球菌Staphyiococcus 金黄色葡萄球菌属革兰氏阳性菌，不含芽胞和鞭毛，是微球菌科葡萄球菌属细菌。在显微 镜下呈葡萄串状。 3.2实时定量聚合酶链反应QuantitativeReal-timePCR） 实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化 学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测 样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 3.3引物Primer 应用化学方法合成一对与已知扩增基因片段两侧DNA序列互补的寡核苷酸，作为PCR扩增 的片段。 3.4模板Tempiate 全国团体标准信息平台 T/DALN029-2023 待扩增的靶DNA。实时荧光定量PCR操作、校准方法均参考YY/T1173聚合酶链反应分析 仪和JJF1527-201聚合酶链反应分析仪校准规范。 4仪器设备和试剂 4.1仪器和设备 4.1.1灭菌处理器具:1.5mL离心管，0.2mL实时荧光定量PCR八联管，微量移液器Tip头。 4.1.2实时荧光定量PCR仪器 4.1.3微量离心机 4.1.4可调微量移液器（10μL～1000μL） 4.1.5微量蛋白-核酸检测仪 4.2试剂 4.2.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂,水为灭菌双蒸水。 4.2.2基因组DNA提取试剂盒 4.2.3AceQUniversalU+ProbeMasterMixV2。 5鉴定金黄色葡萄球菌引物与探针说明 5.1扩增基因 金黄色葡萄球EbpS基因（GenBank:U48826.2）。 5.2引物使用说明 引物EbpS-F、EbpS-R、EbpS-Probe在使用时用灭菌双蒸水稀释成浓度为10umol/L。 5.3探针说明 本实验针对EbpS基因设计TaqMan探针，探针5’端标记为：6-FAM（6-羧基荧光素）； 探针3’端标记为：BHQ1（荧光标记多肽）。 5.4目的片段 预计扩增目的片段134bp。 5.5质控质粒 EbpS-pMD-19-T-DH5α大肠杆菌，涂布LB平板，次日挑取单克隆菌落，无菌操作台内接种 至20mLLB液体培养基，摇床180rpm/min培养12h，取5mL菌液，提取EbpS阳性质粒，用 微量核酸浓度检测仪检测阳性质粒浓度。 6实验方法 全国团体标准信息平台 T/DALN029-2023 6.1样品准备 采集哺乳动物新鲜原乳约（10～20）mL置于灭菌的带盖塑料管中，-20°C冷冻保存备用。 6.2模板制备 按照基因组DNA提取试剂盒的说明书提取各乳样DNA。 6.3检验步骤 6.3.1实验开始前，提前打开实时荧光定量PCR仪，预热30min，根据检测数量和孔反应， 设置荧光收集反应孔数和反应参数，反应程序和条件如下表所示： 表1PCR反应程序要求 PCR反应程序 反应温度 反应循环 污染消化 2 1个循环 预变性 5 1个循环 95℃ 10 45个循环 60℃ 30 45个循环 6.3.2取出8连管置于加样托盘上，并做标记。提取EbpS阳性质粒为阳性对照，以10倍梯 度稀释方法，提取乳样DNA为检测模板，阳性对照和每个乳样添加3个孔，每孔为一个反应 体系，反应体系和条件如下表所示： 表2PCR反应体系 PCR反应体系 反应组分添加量（μL） AceQUniversalU+Probe 10 F、R(10μM) 0.4 TaqManProbe(10μM) 0.2 模板 2 无酶水25μL 6.3.3PCR反应结束后，从实时荧光定量PCR仪中导出各反应孔中反应参数，整理各反应 孔Ct值数据。 6.3.4以阳性质粒不同稀释度Ct值为纵坐标，质粒浓度的对数为横坐标绘制标准曲线。标 全国团体标准信息平台 T/DALN029-2023 准曲线说明：标注曲线因阳性质粒浓度、不同反应批次有所变动，建议每次试验都做阳性对 照，绘制标准曲线，例如为y=-3.3141x+44.364（y为Ct值，x为模板DNA浓度，ng/μL）。 6.3.5数据处理，根据标准曲线，计算每个反应孔中检测核酸浓度。 7结果判定 根据标准曲线计算孔中检测核酸浓度，当孔内DNA浓度超过9.6ng/μL时，判定检测 结果为阳性，即生鲜乳中金黄色葡萄球菌菌落总数大于9.56×104CFU/mL；当孔内DNA 浓度小于9.6ng/μL时，判定检测结果为阴性，生鲜乳中金黄色葡萄球菌菌落总数小于 9.56×104CFU/mL。 8人员防护 实验室工作人员在上班前应进行个人卫生处置，对全身进行喷雾消毒；进入实验室后必 须穿工作衣、戴工作帽、手套、胶套、医用口罩；实验室工作人员在每次接触标本后立即进 行清洗和消毒，手消毒可用75%乙醇或用0.3%～0.5%碘伏，严格按照洗手法搓揉1～2分钟， 洗手应采用非接触式的洗手装置。 9注意事项 实验开始前，提前打开实时荧光定量PCR仪，预热30min；标注曲线因阳性质粒浓度、 不同反应批次有所变动，建议每次试验都做阳性对照，绘制标准曲线；实验须在封闭且室温 不超过25°C内环境进行，以免环境温度影响荧光定量PCR 仪稳定性与灵敏性。 —————————————————— 全国团体标准信息平台