ICS 65.020.01 CCS B 16 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3037—2023 向日葵主要 种传病原真菌室内检测 技术规程 Technical code of practice for indoor detection of main species - borne pathogenic fungi in sunflower seeds 2023-05-11发布 2023-06-11实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3037 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（ SAM/TC 20 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业技术推广中心。 本文件主要起草人： 张之为、萨其仍贵、张键、张文兵、韩升才、杨佳乐、张立华、乌恩、高红宇、 仇凯、王颖、吕明举、赵素梅、张智芳、段钧雷、杜超、刘佳、阿乐达日喜、薛青青。 DB15/T 3037 —2023 1 向日葵主要种传病原真菌室内检测技术规程 1 范围 本文件规定了向日葵种子携带真菌的室内检测和鉴定技术。 本文件适用于室内进行向日葵种子带黄萎病、枯萎病和黑斑病病原菌的检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 向日葵种子样本 用于检测的向日葵种子来自市场上销售的不同向日葵品种。每个向日葵品种随机取 100粒种子。 5 向日葵种子带真菌率的检测与鉴定 向日葵种子真菌带菌率的检测 每一个向日葵品种随机选择 100粒饱满的种子。将种子外壳剥去，取出籽仁，将籽仁放入蒸溜水中 浸泡24 h，用镊子剥下种皮。种皮用 70%乙醇浸泡 1 min，然后用无菌水漂洗两次，每次 1 min。将种皮 放置在灭菌的滤纸上晾干后，放在新鲜制备的 MNP-10选择性培养基（见附录 A）进行培养，培养条件为 24 ℃±2 ℃，每皿放置 10个种皮。待种皮周围出现菌落后，计数菌落的数量 ，统计种子带菌率。 计算 方式见公式 （1）。 X=（A/B）×100%………………（ 1） 式中： X——种子带菌率； A——带菌的种子数； B——供试的种子总数。 种皮携带真菌的形态学鉴定 将菌落转移到新的 PDA培养基上后，利用稀释梯度法进行单孢纯化。对纯化后菌株的菌落形态进行 观察并在显微镜下进行初步的形态学鉴定。 向日葵黄萎病病、向日葵枯萎病及向日葵黑斑病病原菌特征见附录 B、附录C、附录D。 种皮携带真菌的分子生物学鉴定 DB15/T 3037 —2023 2 将在PDA平板培养基上扩繁的真菌的菌落用盖玻片刮下，转入 2 mL的离心管中，然后采用 CTAB方法 提取菌株的 DNA，利用提取的 DNA作为模板进行 PCR鉴定，引物为 ITS1和ITS4。 引物信息： ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’； ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’ PCR程序如下： 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环； 72 ℃延伸10 min。 取5.0 μL PCR扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，剩余的 PCR产物用于测序分析。 PCR产物测 序后获得的序列在 Genbank进行比对，比对结果中同源性达到 99%以上的就可以确定种皮上携带真菌的 种名。 DB15/T 3037 —2023 3 A A 附录 A （资料性） MNP-10培养基配方（ 500 ml） MNP-10培养基配方见表 A.1。 表A.1 为MNP-10培养基配方 配方组成 灭菌方法 Part 1 PGA 5.0 g ，NaOH 4.0 g 121 ℃，15 min Part 2 KNO3 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，KCL 0.5 g ，MgSO 4.7H2O 0.5 g， Tergitol 0.5 ml ，琼脂粉 15.0 g 121 ℃，15 min Part 3 氯霉素 25 mg，链霉素 25 mg，金霉素 25 mg 过滤灭菌