ICS 65.020.01 CCS B 04 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2996—2023 牧草中维生素 E的测定 高效液相色谱法 Determination of Vitamin E in forage grass high - performance liquid chromatography 2023-05-11发布 2023-06-11实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2996 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农畜产品质量安全中心、鄂托克旗农 畜产品质量安全工作站、内蒙古自治区农牧业技术推广中心饲料饲草技术处、锡林郭勒盟农牧业科学研 究所、阿拉善盟农畜产品质量安全中心。 本文件主要起草人：王文曦、吴洪新、云颖、康博洋、盈盈、刘宇宁、湖日尔、张燕东、宁淑红、 李曙光、李润航、朝鲁孟、刘江英、刘洪林、卫媛、蔡婷、降晓伟、赵志惠、李坤娜、李薇、付慧。 DB15/T 2996 —2023 1 牧草中维生素 E的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了牧草中维生素 E（α-生育酚）的高效液相色谱测定。 本文件适用于牧草中维生素 E（α-生育酚）的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的维生素 E（α-生育酚）经皂化、提取、净化、浓缩后， C18反相液相色谱柱分离，紫外检测 器检测，外标法定量。 5 试剂和材料 无水乙醇（ C2H5OH）：经检查不含醛类物质。 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 石油醚（ C5H12O2）：沸程为 30 ℃～60 ℃。 无水乙醚［（ CH3CH2）2O］：经检查不含过氧化物质。 抗坏血酸（ C6H8O6）。 无水硫酸钠（ Na2SO4）。 2,6二叔丁基对甲酚（ C15H24O）：简称 BHT。 氢氧化钾（ KOH）。 氢氧化钾溶液（ 50 g/100 g ）：称取 50 g氢氧化钾，加入 50 mL水溶解，冷却后，储存于聚乙烯 瓶中。 DB15/T 2996 —2023 2 维生素E（α-生育酚）标准品： α-生育酚（ C29H50O2，CAS号：10191410 ）纯度不小于 95%，或经 国家认证并授予标准物质证书。 维生素E（α-生育酚）标准储备液（ 1.0 mg/mL ）：准确称取适量的维生素 E（α-生育酚）标准 物质，用甲醇溶解并配制成（ 1.0 mg/mL ）的标准储备液，保存于 -18 ℃冰箱内，有效期 6个月。 维生素E（α-生育酚）标准使用液 (100 μg/mL)：准确吸取 1.0 mL维生素E（α-生育酚）的标 准储备液至 10.0 mL 棕色容量瓶内，用甲醇稀释定容至刻度，配制成 100.0 μg/mL的标准使用溶液， 于-18 ℃冰箱内避光保存，有效期 1个月。 维生素E（α-生育酚）标准系列工作液：分别吸取浓度为 100.0 μg/mL维生素E（α-生育酚） 标准液0.20 mL、0.50 mL、1.5 mL、2.0 mL、5.0 mL于10.0 mL棕色容量瓶，用甲醇定容至刻度，该 标准系列维生素 E（α-生育酚）浓度分别为 2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、15.0 μg/mL、20.0 μg/mL、 50.0 μg/mL，有效期 7天。 微孔过滤膜： 0.45 μm有机相。 水为GB/T 6682 规定的一级水。 6 仪器和设备 高效液相色谱仪：配有紫外检测器（或二极管阵列检 测器）。 分析天平：感量 0.01 mg和0.01 g。 恒温水浴振荡器。 超声波水浴。 旋转蒸发仪。 涡旋混合器。 氮吹仪。 组织粉碎机。 样品筛：筛孔尺寸 1.0 mm。 7 试样制备 按照GB/T 14699.1 中有关规定采集样品，去杂质后充分混匀，按照 GB/T 20195 制备试样，利用四分 法取样后，充分粉碎，过 1.0 mm筛，将处理好的试样常温避光保存。 8 测定步骤 皂化 称取试样 2 g～5 g（精确至 0.01 g）于150 mL的平底烧瓶中，加入约 20 mL温水，混匀，再加入 1.0 g抗坏血酸（ 5.5）和0.1 g BHT （5.7），混匀，加入 30 mL的无水乙醇（ 5.1），加入 10 mL～0 mL氢氧 化钾溶液（ 5.9），边加边振摇，混匀后于 80 ℃恒温水浴震荡皂化 30 min,皂化后立即用冷水冷却至室 温。 提取 称取试样 2 g～5 g（精确至 0.01 g）于150 mL的平底烧瓶中，加入约 20 mL温水，混匀，再加入 1.0 g抗坏血酸（ 5.5）和0.1 g BHT （5.7），混匀，加入 30 mL的无水乙醇（ 5.1），加入 10 mL～0 mL氢氧 DB15/T 2996 —2023 3 化钾溶液（ 5.9），边加边振摇，混匀后于 80 ℃恒温水浴震荡皂化 30 min,皂化后立即用冷水冷却至室 温。 洗涤 用约100 mL水洗涤醚层，约重复 2～3次，直至将醚层洗至中性，去除下层水相。 浓缩 将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（ 5.6，约3 g）滤入250 mL旋转蒸发瓶中，用约 15 mL石油醚（ 5.3） 冲洗分液漏斗及无水硫酸钠 2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上，于 40 ℃水浴 中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚液剩下 2 mL时，取下蒸发瓶，转移至 10 mL比色管中，并用石油醚冲 洗2～3次，立即用氮气吹至近干，取下加入 0.5 mL无水乙醚（ 5.4），再次吹至近干，用甲醇（ 5.2）定 容至5.0 mL。溶液过 0.45 μm 有机相滤膜，待测。 测定 8.5.1 液相色谱条件 具体参考条件如下： a) 色谱柱： C18型柱，长 150 mm，内径4.6 mm，粒径5.0 μm或等效的色谱柱； b) 流动相： A:甲醇（5.2）+B:水=98+2（v/v）； c) 流速：1.0 mL/min ； d) 进样量： 10.0 μL； e) 柱温：室温； f) 检测波长： 280 nm。 8.5.2 标准曲线的制定 按照8.5.1测定条件，将标准工作液（ 5.13）注入高效液相色谱仪中进行测试。 测定相应的峰面积， 以标准工作液（ 5.13）的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 8.5.3 试样溶液的测定 按照8.5.1测定条件，将待测样品溶液注入高效液相色谱仪中进行测试。待测样品溶液中目标物质 的响应值应在仪器线性范围内，否则应适当稀释。标准工作液与待测样品溶液等体积进样。根据标准溶 液色谱峰的保留时间和峰面积， 对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性，外标法定量。 维生素 E（α -生育酚）标准溶液色谱图参见附录 A中图A.1。 平行实验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。 空白实验 除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。 9 结果计算和表示 试样中维生素 E(α-生育酚）含量 X按式（1）计算： DB15/T 2996 —2023 4 X=(C−C0)×V m×1000 1000…………………………………………(1) 式中： X ——试样中维生素 E（α-生育酚）的含量，单位为毫克每千克（ mg/kg）； C ——待测试样中维生素 E（α-生育酚）的浓度，单位为微克每毫升（ µg/mL）； C0 ——试剂空白中维生素 E（α-生育酚）的浓度，单位为微克每毫升（ µg/mL）；； V ——试样溶液定容体积，单位为毫升（ mL）； 1000 ——换算系数； m ——试样的称样量，单位为克（ g）； 1000 ——换算系数。 结果用2次平行测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字，结果以干基计。 10 精密度和定量限 精密度 在重复性条件下获得的 2次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均值 10%。 定量限 本文件维生素 E的定量限为 2.0 mg/kg 。