ICS 67.120.10 CCS X22 T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T /ZNZ 188—2023 肉制品中胭脂红、刚果红、酸性橙Ⅱ的测定 高效液相色谱法 Determination of Ponceau 4R ，Congo Red and Acid Orange Ⅱ in Meat Products ——High Performance Liquid Chromatography 2023 - 05 - 11发布 2023 - 06 - 11实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 188—2023 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：绿城农科检测技术有限公司、浙江工业大学、浙江农都农产品供应链有限公司。 本文件主要起草人：闻佳钰、关荣发、林婷、何丽娜、董叶箐、卢劼、刘强欣、俞婕、刘芯成、凌 程江、黄建萍、李燕、王啸、时玉萍。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 188—2023 2 肉制品中胭脂红、刚果红、酸性橙 Ⅱ的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件描述了高效液相色谱 法测定肉制品中胭 脂红、刚果红、酸性橙 Ⅱ的方法。 本文件适用于 发酵肉制品、酱卤肉制品、熟肉干制品、熏烧烤肉制品、熏煮香肠火腿等 肉制品中胭 脂红、刚果红、酸性橙 Ⅱ含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要 界定的术语和定义。 4 原理 试样经石油醚 30℃～60℃脱脂后， 用氨水 -乙醇溶液超声提取胭脂红、刚果红、 酸性橙 Ⅱ，浓缩后用 甲醇溶液溶解 ，用高效液相色谱 -二极管阵列检测器 测定,外标法定量。 5 试剂和材料 除非另有说明， 所有试剂均为 分析纯，水为 符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 甲醇（CH 3OH）：色谱纯 。 5.1.2 乙醇（ C2H5OH）。 5.1.3 石油醚（ C5H12O2）：沸程 30℃～60℃。 5.1.4 氨水（ NH 4OH）。 5.1.5 乙酸铵（ C2H7NO 2）。 5.2 溶液配制 5.2.1 氨水-乙醇溶液 （30%，V/V）：量取氨水（ 5.1.4）300 mL，乙醇（ 5.1.2）700 mL，混匀。 5.2.2 甲醇水溶液 （50%，V/V）：量取甲醇（ 5.1.1）50 mL，加水至 100 mL，混匀。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 188—2023 3 5.2.3 乙酸铵溶液 （0.02 mol/L）：称取 1.54 g乙酸铵（ 5.1.5），加水至 1000 mL，溶解，经 0.45 μm 微孔滤膜过滤 。 5.3 标准品 5.3.1 胭脂红（C20H11O10N2S3Na3，CAS 号： 2611 -82-7），纯度≥ 99.0%，或经国家认证并授予标准 物质证书的标准物质 。 5.3.2 刚果红（C32H22N6Na2O6S2，CAS 号： 573-58-0），纯度≥ 99.0%，或经国家认证并授予标准物 质证书的标准物质 。 5.3.3 酸性橙Ⅱ（C16H11N2NaO 4S，CAS 号： 633-96-5），纯度≥ 99.0%，或经国家认证并授予标准物 质证书的标准物质 。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 标准贮备液（ 1.00 mg/mL ）：分别准确称取 胭脂红、刚果红、酸性橙Ⅱ 各0.1 g（精确至 0.0001 g），置于 100 mL容量瓶中，加甲醇 水溶液（ 5.2.2）溶解并定容。 5.4.2 混合标准中间液（ 50 mg/L）：取0.5 mL标准储备液（ 5.4.1）置于 10 mL 容量瓶中 用甲醇水溶 液（ 5.2.2）定容。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪：配二级管阵列检测器。 6.2 电子天平：感量 0.1 mg和0.001 g。 6.3 高速离心机：转速≥ 4 000 r/min 。 6.4 旋转蒸发仪。 6.5 超声波清洗器。 6.6 涡旋混合器。 6.7 混合微孔滤膜：孔径 0.22 μm。 7 分析步骤 7.1 试样制备 取200 g以上有代表性的试样，切成小块，组织捣碎机捣碎，均质后分成 2份，分别作为试样和留样， 并装入洁净容器中，密封并标记，于﹣ 18 ℃避光保存。 7.2 试样溶液制备 称取试样 5 g（精确至 0.001 g）于 50 mL离心管中，加入 石油醚（5.1.3）20 mL，涡旋 3 min，静置 10 min，弃去石油醚 ；重复此操作 3次，待石油醚完全挥干后，加入氨水-乙醇溶液（5.2.1）20 mL，涡旋 混匀，超声提取 20 min，然后冷却至室温后，以 4000 r/min 离心 3 min，取全部上清液，重复提取 3次，合 并上清液置于至 250 mL鸡心瓶中， 于60 ℃水浴减压浓缩 至近干，加 甲醇水溶液 （5.2.2）溶解并定容 至 5 mL，过膜，上机。 标准曲线的制作 ：将混合标准中间液（ 5.4.2）用甲醇 水溶液（5.2.2）逐级稀释成 0.05 mg/L 、0.1 mg/L、 0.2 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L的标准系列溶液 .将混合标准系列工作溶液注入 高效液相色谱仪中， 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 188—2023 4 测定相对应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工 作曲线。 7.3 色谱条件 7.3.1 色谱柱： C18（4.6 mm× 250 mm ，5 μm），或性能相当者 。 7.3.2 二极管阵列检测器波长： 500 nm。 7.3.3 柱温： 35 ℃。 7.3.4 进样量： 50 μL。 7.3.5 流速： 1 mL/min 。 7.3.6 流动相：流动相 A为0.02 mol/L 乙酸铵溶液， B为甲醇。 7.3.7 梯度洗脱条件：见表 1。 表1 梯度洗脱 条件 时间（min） A（%） B（%） 0.0 90 10 5.0 90 10 10.0 30 70 15.0 30 70 17.0 90 10 20.0 90 10 8 结果计算 试样中胭脂红、刚果红、酸性橙 Ⅱ含量按式（ 1）计算或仪器数据处理软件计算获得： mVCX= （1） 式中： X ——试样中待测组分含量，单位为 毫克每千克 （mg/kg）； C ——由标准曲线得出的 试样溶液 中待测物的质量浓度，单位为毫克每升（ mg/L）； V ——试样定容体积 ，单位为毫升（ mL）； m ——试样的质量，单位为克（ g）； 测定结果以平行测定的算术平均值表示， 结果保留 3位有效数字 。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的 绝对差值不 应超过算术平均值的 10 %。 10 回收率 本方法在 0.05 mg/kg ～1.0 mg/kg 添加浓度水平上的回收率在 70 %～110 %之间。 11 定量限 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 188—2023 5 本方法胭脂红、 刚果红、酸性橙 Ⅱ定量限均 为0.05 mg/kg 。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 188—2023 6 附 录 A (资料性) 胭脂红、刚果红、酸性橙 Ⅱ标准溶液高效液相色谱图 胭脂红、刚果红、酸性橙 Ⅱ标准溶液高效液相色谱图见图 A.1。 图A.1 胭脂红、刚果红、酸性橙Ⅱ 标准溶液高效液相色谱图（ 1 mg/L） _________________________________ 全国团体标准信息平台