ICS65.060.99 CCSB90T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ161—2023 水产品中五氯酚钠残留的快速检测 胶体金免疫层析法 Rapiddetectionofpentachlorophenolsodiumresidueinaquaticproducts Colloidalgoldimmunochromatographicmethod 2023-01-18发布 2023-02-18实施 浙江省农产品质量安全学会发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ161—2023 I前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省水产技术推广总站。 本文件主要起草人：李诗言、柯庆青、王鼎南、周钦、王扬、何辉、张宜明、陆炜、吴洪喜、丁雪 燕。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ161—2023 1水产品中五氯酚钠残留的快速检测胶体金免疫层析法 1范围 本文件规定了水产品中五氯酚钠的胶体金免疫层析快速检测方法。 本文件适用于鱼、虾、蟹、鳖、蛙、贝等中五氯酚钠残留的快速测定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB23200.92-2016食品安全国家标准动物源性食品中五氯酚残留量的测定液相色谱-质谱法 GB/T30891水产品抽样规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 本方法的测定采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的五氯酚钠经有机试剂两次萃取，固相萃取小柱 净化，浓缩复溶后，五氯酚钠与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（Ｔ 线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对 样品中五氯酚钠进行定性判定。 5试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。 5.1试剂 5.1.1乙腈（CH3CN）。 5.1.2正己烷（C6H14）。 5.1.3氨水（NH3·H2O）：含量为25%~28%。 5.1.4硫酸（H2SO4）：ρ=1.83g/mL。 5.1.5无水硫酸钠（Na2SO4）：650℃灼烧4h，冷却后贮于密闭干燥容器中备用。 5.1.6氯化钠（NaCl）。 5.1.7二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ161—2023 25.1.8十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。 5.1.9表面活性剂S9（[-CH2N[(-CH2CH2O-)x[-CH2CH(CH3)O-]yH]2]2）。 5.2参考物质 五氯酚钠参考物质的中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥94.5%。 表1五氯酚钠标准物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量 中文名称 英文名称 CAS号 分子式 相对分子质量 五氯酚钠Pentachlorophenol sodium131-52-2 C6Cl5NaO 288.32 5.3试剂配制 5.3.1提取液A：硫酸（5.1.4）和水按体积比1：99混合。 5.3.2乙腈溶液：乙腈（5.1.1）和水按体积比3：1混合。 5.3.3萃取液B：乙腈溶液（5.2.2）和氨水（5.1.3）按体积比23：2混合。 5.3.4复溶液C：磷酸盐缓冲液（10mmol/L），称取8.00g氯化钠（5.1.6）、2.77g十二水合磷酸氢 二钠（5.1.8）、0.352g二水合磷酸二氢钠（5.1.7），5.00g表面活性剂S9（5.1.9），用水溶解并定容 至1L，过滤，经121℃灭菌15min。 5.4标准溶液配制 5.4.1五氯酚钠标准储备液（以五氯苯酚计，100μg/mL）：取五氯酚钠（5.2）参比物质适量（相当于 五氯苯酚10mg），用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，混匀，将溶液转移至棕色玻璃储存瓶 中，-18℃下避光保存，有效期12个月。 5.4.2五氯酚钠标准中间液（以五氯苯酚计，1μg/mL）：准确量取1mL五氯酚钠标准储备液（5.4.1）， 置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，混匀，将溶液转移至棕色玻璃储存瓶中，4℃下避光保存， 有效期3个月。 5.4.3五氯酚钠标准工作液（以五氯苯酚计，100ng/mL）：准确量取1mL五氯酚钠标准中间液（5.4.2）， 置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，混匀，现配现用。 5.5材料 5.5.1固相萃取小柱：EMR-Lipid小柱（3cc，300mg），或者使用性能相当固相萃取柱。 5.5.2五氯酚钠胶体金免疫层析试剂盒：一般包含胶体金检测卡/试纸条、金标微孔及配套的试剂，密 封包装，按产品要求保存。 6仪器和设备 6.1电子天平：感量0.01g和0.0001g。 6.2均质机：转速≥8000r/min。 6.3离心机：转速≥4000r/min。 6.4氮气吹干仪或空气吹干仪。 6.5旋涡仪：转速0r/min～3000r/min。 6.6固相萃取装置。 6.7微量移液器：10μL～100μL，100μL～1000μL。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ161—2023 36.8胶体金读数仪（必要时）。 7测定步骤 7.1抽样 按照GB/T30891要求进行抽样，参考表A.1填写采样信息记录。 7.2试样制备与保存 鱼、虾、蟹、鳖、贝等水产品按照GB/T30891要求进行制样。蛙类去头、皮、内脏，取肌肉部分充 分均质混合，直至成肉糜的状态（特殊要求除外）。将试样分成检样和备样两份，并做标记，每份不少 于50g。检样立即测试或-18℃以下冷冻待测，备样-18℃以下冷冻保藏，有效期不超过3个月。 7.3提取与净化 准确称取样品4g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，加入8mL提取液A（5.3.1），旋涡均匀后再 加入5g无水硫酸钠（5.1.5）和5mL正己烷（5.1.2），震荡提取5min后以4000r/min离心5min。转移全 部上层正己烷溶液于10mL带盖离心管中，加入2mL萃取液B（5.3.3），手摇混匀1min后以4000r/min 离心5min。弃去上层正己烷溶液；准确移取1.5mL下层溶液于固相萃取小柱（5.5.1）上，使用空气压 力保持1s/滴过滤速度，收集全部滤液；移取400μL滤液于40℃下氮吹或空气吹干后，加入200μL复溶 液C（5.3.4）复溶，待测定。 注：可用洗耳球或其他等效装置产生空气压力。 7.4测定 取出五氯酚钠免疫胶体金快速检测卡/试纸条和金标微孔，并恢复至适宜工作温度（20℃±5℃）。 吸取100μL待测液置于金标微孔（5.5.2）中，反复抽吸5到10次，静置孵化3min。吸取100μL混匀液滴 于检测卡（5.5.2）加样孔中反应5~8min，并在2min内判读结果。 7.5质控试验 每批样品应同时进行空白和阴性、阳性对照试验。 7.5.1空白对照 每批样品需做一孔空白对照，以复溶液C（5.3.4）代替样品测定液，按7.4步骤进行操作。 7.5.2阴性对照 称取同类基质空白样品，按7.3和7.4步骤进行操作。 7.5.3阳性对照 准确称取同类基质空白样品4g（精确至0.01g），置于50mL离心管中，加入适量五氯酚钠标准工 作液（5.4.3），使样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量达到检出限或2倍检出限，按7.3和7.4步骤进行 操作。 8结果判定要求 全国团体标准信息平台 T/ZNZ161—2023 4可使用胶体金读数仪对结果进行判读，具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视 法对结果进行判读时，目视判定示意图见图1和图2所示。 8.1比色法 8.1.1阴性结果 检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当， 表明样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量低于方法检出限，判定为阴性。 8.1.2阳性结果 检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中五氯酚钠（以五 氯苯酚计）含量高于方法检出限，判定为阳性。 8.1.3无效结果 控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 图1目视判定示意图（比色法） 8.2消线法 8.2.1阴性结果 检测线（T线）和控制线（C线）均显色时，表明样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量低于方法 检出限，判定为阴性。 8.2.2阳性结果 检测线（T线）完全不显色时，表明样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量高于方法检出限，判定 为阳性。 8.2.3无效结果 控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ161—2023 5 图2目视判定示意图（消线法） 8.3质控试验要求 每批样品应设置不低于10%比例的平行样，空白和阴性对照样品各1个，阳性对照样品2个(大于 检出限和检出限各一个)，进行空白和阴性、阳性对照质控试验。当平行样之间的检测结果一致，且空 白和阴性、阳性对照试验的结果准确时，判定该批样品检测数据有效，并参照表A.2记录试验结果。 9结论 本方法检测结果为阳性的样品，须采用GB23200.92作为参比方法进行确证。根据确证结果，参照 表A.3填写结