ICS11.220 CCSB41 21 辽宁省地方标准 DB21/T3785—2023 牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测技术 规程 DetectionofbrucellosisincattleandsheepbyFluorescencePolarization Assay(FPA) 2023-07-30发布 2023-08-30实施 辽宁省市场监督管理局  发布 DB21/T3785—2023 I目次 前言..................................................................................II 1范围................................................................................1 2规范性引用文件......................................................................1 3术语和定义..........................................................................1 4缩略语..............................................................................1 5生物安全要求........................................................................1 6技术原理............................................................................1 7设备试剂与材料......................................................................2 8样品采集和处理......................................................................2 9操作前准备工作......................................................................2 10试验操作...........................................................................2 附录A（规范性）试剂配制..............................................................5 DB21/T3785—2023 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、锦州市疾病预防控制中心、哈尔滨平河生物技术有限 公司、辽宁中科基因技术有限公司。 本文件主要起草人：张雅为、于本良、顾贵波、兰德松、朱江巍、王克才、陈瑶、段亚良、李井春、 孙世宇、魏澍、张辉、刘坤洋、刘佳、白梅、张旭、李泽钦、张祎。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。 文件起草单位通讯地址:辽宁省农业发展服务中心（沈阳市沈北新区人和街95号），联系电话： 024-88420057。 DB21/T3785—2023 1牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测技术规程 1范围 本文件规定了牛、羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测的生物安全要求、技术原理、设备试剂与材 料、样品采集和处理、操作前准备、试验操作等技术内容。 本文件适用于牛、羊布鲁氏菌抗体水平的初筛检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 FPA:荧光偏振检测（FluorescencePolarizationAssay） mP:荧光偏振值（MillipolarisationUnits） OPS:O-多糖（O-Polysaccharide） DEAE:二乙氨基乙基葡聚糖 FITC:荧光素异硫氰酸酯 5生物安全要求 为了保护实验室检测人员的安全，实验操作应在相应级别的生物安全实验室内进行，严格按照GB 19489和NY/T1948要求执行。 6技术原理 溶液中的分子作随机转动，分子的大小是影响转动速率的主要因素，与其成反比关系，因而小分子 较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过68.5º角度的转动时间，可以通过测量水平和垂 直的偏振光强度来确定。 DB21/T3785—2023 2诊断布鲁氏菌病时，采用牛种布鲁氏菌LPS的小分子量片段(平均22KD)，标记荧光素异硫氰酸酯 (FITC)作为抗原，被检血清中若有抗体存在，与标记抗原结合后就会降低其转动速度，使用荧光偏振分 析仪测定出偏振值，通过偏振值判断样品的阴、阳性。 7设备试剂与材料 设备 荧光偏振检测仪（试管型便携式FPA仪、台式FPA分析仪）、微量移液器（1µL～10µL、20µL～200 µL、100µL～1000µL）、多道移液器（10µL～200µL）、旋涡振荡器。 试剂 标准阳性血清（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂）、标准阴性血清（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试 剂）、FPA标记抗原（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂，配置方法见附录A.1）、FPA样 品稀释液（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂，配置方法见附录A.2）、氯化钠、Tris、 Tween-20、EDTA。 材料 10mm×75mm硼硅玻璃试管（试管应清洁无指纹等，且无刮痕）、96孔黑色平底微量板、吸头（10 µL、200µL、1000µL）。 8样品采集和处理 按照NY/T541中的方法采集和分离受检牛、羊的血清，分离后的血清应清亮透明没有溶血现象和腐 败现象，血清量通常为1mL备用。 9操作前准备工作 将试剂和样品恢复至室温（18℃～26℃），检测操作应在室温（18℃～26℃）下进行。 10试验操作 试管法检测 10.1.1仪器校准 10.1.1.1每天第1次试验前或FPA检测仪被移动后，都要检测对照血清。 10.1.1.2在两个10mm×75mm硼硅玻璃试管中分别加入1mL的FPA样品稀释液。 10.1.1.3在两个试管中分别加入10µL的阳性和阴性对照血清，充分混合均匀（旋涡混合器振动5s）。 10.1.1.4使用试管型便携式FPA仪分别读取两管的空白密度值。 10.1.1.5每管加入10µL的FPA标记抗原，充分混合均匀（旋涡混合器振动5s）。 10.1.1.6孵育至少2min，最长不超过5min。 10.1.1.7使用便携式FPA仪读取两管的mP值。试管的检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。 DB21/T3785—2023 310.1.1.8对照结果：阴性对照牛血清的mP值低于90mP（通常在75mP左右）；阳性对照血清的mP 值在200mP左右，则对照成立，可以进行样品检测。否则，按照FPA仪器的操作软件和操作程序，调 试FPA检测仪的参考因子值，使对照成立，才可进行样品的检测。 10.1.2样品检测 10.1.2.1向每个10mm×75mm硼硅玻璃试管加入1mL的FPA样品稀释液，试管数量等于样品数量。 10.1.2.2在上述试管中加入待检血清，用旋涡混合器振动5s充分混合均匀。各畜种血清稀释度具体 如下： a)牛血清按10µL血清加到1.0mL样品稀释液中稀释； b)绵羊血清按25µL血清加到1.0mL样品稀释液中稀释； c)山羊血清按40µL血清加到1.0mL样品稀释液中稀释。 10.1.2.3使用试管型便携式FPA仪读取被检样品试管的空白密度值。 10.1.2.4在上述试管中加入10µL的FPA标记抗原，旋涡混合器振动5s充分混合均匀。 10.1.2.5孵育2min～5min。 10.1.2.6使用试管型便携式FPA仪读取被检样品的mP值。试管的测量顺序与读取空白密度值时的顺 序一致。 10.1.3结果判定 10.1.3.1没有接种布鲁氏菌病疫苗的动物：样品mP值大于其阈值时，判为阳性；mP值小于阈值时， 判为阴性；mP值等于阈值时，需重新检测。牛、羊血清阈值如下： a)牛血清阈值为95mP； b)绵羊血清阈值为78mP； c)山羊血清阈值为88mP。 10.1.3.2已经接种A19疫苗12个月以后或接种S2疫苗6个月以后的动物： a)牛血清＜95mP为阴性；95mP≤检测值≤115mP为可疑；≥116mP为阳性； b)绵羊＜78mP为阴性；78mP≤检测值≤88mP为可疑；＞88mP为阳性； c)山羊＜88mP