ICS65.020.20 CCSB30DB36 江西省地方标准 DB36/T1799—2023 茶树菇菌种鉴定技术规程 TechnicalregulationsofidentificationforCyclocybeaegeritaspawn 2023-07-01发布 2024-01-01实施 江西省市场监督管理局发布 DB36/T1799—2023 I目  次 前言.................................................................................II 1范围...............................................................................1 2规范性引用文件.....................................................................1 3术语和定义.........................................................................1 4试剂和仪器.........................................................................2 5鉴定方法...........................................................................2 附录A（规范性）培养基制备.............................................................7 附录B（规范性）试剂及其制备...........................................................8 附录C（资料性）仪器..................................................................11 附录D（规范性）拮抗反应类型..........................................................12 附录E（资料性）试验用引物参照........................................................13 DB36/T1799—2023 II前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院农业应用微生物研究所、江西省农业技术推广中心。 本文件主要起草人：王洪秀、魏云辉、龚正、胡佳、冯艳、孙鹏、陈绪涛、袁梦涵。 DB36/T1799—2023 1茶树菇菌种鉴定技术规程 1范围 本文件规定了茶树菇菌种鉴定的过程，包括试剂和仪器、样品制备、试验步骤、试验数据处理等内 容。 本文件适用于江西省茶树菇菌种鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T1097食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法 NY/T1730食用菌菌种真实性鉴定ISSR法 NY/T1845食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应 3术语和定义 NY/T1845、NY/T1097和NY/T1730界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 茶树菇Cyclocybeaegerita 茶树菇Cyclocybeaegerita隶属于真菌界FungiKingdom、担子菌门Basidiomycota、伞菌纲 Agaricomycetes、伞菌亚纲Agaricomycetidae、伞菌目Agaricales、假脐菇科Tubariaceae、环伞属Cyclocybe， 分布于我国江西、福建、云南、浙江及四川等地。因其生长宿主的多样性及形态上的细微差别，又被称 为杨树菇、柳松茸、柳环菌。生产上有褐色和白色两个品种。褐色品种特征：子实体单生或丛生。菌盖 表面平滑，呈浅土黄色至暗红褐色；菌褶污黄褐色；菌柄较长，脆嫩，纤维质，表面有纤维状条纹，近 白色；内菌幕膜质，开伞后菌环留在菌柄上部或沾附于菌盖边缘或自动脱落。白色品种特征：除菌盖、 菌柄和菌褶呈白色外，其他形态特征基本同褐色品种，此品种又称雪莲菇。 3.2 菌种区别性distinctnessofspawn 供检菌种和对照菌种的不符合性。 [NY/T1845，定义3.1] 3.3 隆起型ridgy 对峙培养的茶树菇菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界处菌丝隆起。 DB36/T1799—2023 2[NY/T1845，定义3.2] 3.4 沟壑型chimb 对峙培养的茶树菇菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌丝在交界处分别密集或稍微隆起，两 隆起之间出现一条沟壑状分隔线。 3.5 色线型colorbar 对峙培养的茶树菇菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界处形成一条色素分界线。 3.6 隔离型dividingline 对峙培养的茶树菇菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界出现一条无菌丝的带状分隔 区。 3.7 菌种真实性genuinenessofspawn 供检菌种和对照菌种的符合性。 [NY/T1097，定义3.1] 3.8 对峙培养法face-offculture 两个不同的菌株对峙培养时发生拮抗反应，是茶树菇菌株识别异己保持群体遗传多样性的反应，它 是由基因组内异核体不亲和位点控制的。当不亲和的两个菌株对峙培养时，在菌株交界处形成隆起、沟 壑、色线或隔离，产生拮抗，防止遗传上明显不同的个体间菌丝融合，以保持个体遗传上的独立和稳定。 3.9 酯酶同工酶法esteraseisoenzymemethod 在生物中，酶的表达受遗传基因的调控。酯酶是多等位基因调控的酶类，从食用菌菌丝体中提取的 粗酶液经电泳后，进行酯酶的生物化学染色，不同的酯酶组分显示在凝胶的不同位置而形成酯酶同工酶 酶谱。相同的菌种遗传背景相同，其酯酶同工酶酶谱也相同。因此可以用酯酶同工酶酶谱对茶树菇菌种 的真实性进行鉴定。 3.10 ISSR法intersimplesequencerepeattechnique 以锚定微卫星DNA为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，得到与锚定引物互补的重复序列的区间 DNA片段。不同物种基因组DNA中的这种反相重复的微卫星序列的数目和间隔的长短不同，就可导致 这些特定结合位点分布发生相应的变化，从而使PCR产物增加、减少或发生分子量的改变。通过对PCR 产物的检测和比较，即可识别茶树菇菌种基因组DNA的多态片段，从而鉴定菌种的真实性。 DB36/T1799—2023 34试剂和仪器 培养基制备及试剂要求按照附录A和附录B执行，仪器按照附录C准备。 5鉴定方法 5.1对峙培养法 5.1.1菌丝体培养 供检茶树菇菌株与对照菌株在相同条件下培养，将固体菌种从试管斜面接种到直径90mm固体PDA 平板上，25℃避光培养15d。 5.1.2接种组合与重复次数 茶树菇供检菌株与对照菌株的拮抗反应接种组合为3组，每组重复3次。第一组：供检菌株与对照菌 株对峙培养；第二组：供检菌株与供检菌株对峙培养；第三组：对照菌株与对照菌株对峙培养。 5.1.3接种操作 严格按无菌操作，用单孔直径5mm打孔器分别打取活化后适龄的茶树菇供检菌株与对照菌株菌落 边缘做接种块，菌丝朝上，两接种块间隔30mm，置于平板中心位置。 5.1.4培养条件 在通风、避光、温度为25℃条件下培养至接种块菌丝接触，需20d～25d。 5.1.5判定规则 在自然光下，观察对峙培养的两株菌落交界处菌丝，有隆起型、沟壑型、色线型、隔离型四者之一 的拮抗反应，判定为不同菌株，见附录D。 5.2酯酶同工酶法 5.2.1液体培养 直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25℃，180rpm振荡避光培养20d。培养基的制备参见附 录A.2。 5.2.2酯酶同工酶样品制备 5.2.2.1将振荡培养的茶树菇菌丝球过滤除去水分，获得供检茶树菇供试菌株与标准菌株的菌丝体各3 份。称取菌丝体0.5g于1.5mL离心管中，放入冷冻干燥机中低温冷冻干燥24h。 5.2.2.2向每个装样品的离心管中加入小钢珠并将离心管放入组织研磨仪中，60Hz下研磨30s成细粉 末，加入0.5mL样品提取液（附录B.1）。 5.2.2.3将研磨后的样品在4℃下12000rpm，离心10min，取其上清液，将上清液和上样缓冲液按10:1 比例混匀，混合液即为电泳样品。 5.2.3凝胶制备 DB36/T1799—2023 45.2.3.1分离胶 分离胶浓度7.5%，按照分离胶缓冲液（附录B.3）:分离胶母液（附录B.5）:双蒸水:过硫酸铵（附 录B.2）=2:5:1:8的比例配制，再加入胶溶液体积0.1%的TEMED，充分混匀。将分离胶灌入胶室至距短 玻璃板上沿2.2cm～2.5cm，加入适量的水封住胶面，待凝胶聚合后将水吸出。 5.2.3.2浓缩胶 浓缩胶浓度3%，按照浓缩胶缓冲液（附录B.4）:浓缩胶母液（附录B.6）:双蒸水:过硫酸铵（附录 B.2）=1:2:1:4比例混合，再加入胶溶液体积0.1%的TEMED，充分