ICS 65.020.20 CCS B 21 23 黑龙江省 地方 标准 DB23/T 3529—2023 玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种技术 规程 2023 - 07 - 21发布 2023 - 08 - 20实施 黑龙江省市场监督管理局 发布 DB23/T 3529 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容可能仍涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利 的责任。 本文件由黑龙江省农业农村厅提出。 本文件起草单位：东北农业大学。 本文件主要起草人： 王振华，邸宏，周羽， 张林，宋永峰，刘显君，董玲，曾兴，李春翔，贾悦， 周润宇，朱勇。 DB23/T 3529 —2023 II 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时涉及专利 ——（1）与玉米抗丝黑穗病次主效位点 紧密连锁的分子标记 DNdCaps8.03 -1及其应用， 专利号： ZL201611147933.9 ；（2）基于玉米抗丝黑穗病 候选基因 ZmNL开发的分子标记 LSdCAP8及其应用， 专利号： ZL201410675830.4 ；（3）与玉米抗丝黑穗病 基因连锁的 SNP位点、基于该位点的分子标记 LSdCAP3及其应用， 专利号： ZL201210031213.1 ；（4）与 玉米抗丝黑穗病基因连锁的 SNP位点、基于该位点的分子标记 LSdCAP2及其应用， 专利号： ZL201210031438.7 。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利的持有 人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理、无歧视的条款和条件下就专利授权可进行 谈判，该专利持有人的声明已在本文件的 发布机构备案 。相关信息可通过以下联系方式获取： 专利持有人： 东北农业大学 地址：黑龙江省哈尔滨市香坊区长江路 600号 邮政编码： 150030 联系人： 周羽 联系电话： 0451-55190581 邮箱：zhouyu0924@126.com DB23/T 3529 —2023 1 玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种技术规程 1 范围 本文件规定了玉米抗丝黑穗病多标记分子辅助育种技术的术语和定义、 仪器、 育种材料及育种程序。 本文件适用于玉米 (Zea mays L. ）抗丝黑穗病多标记分子辅助育种。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1248.3-2006 玉米抗病虫性鉴定技术规范 第3部分：玉米抗丝黑穗病鉴定技术规范 NY/T 1432 -2014 玉米品种鉴定技术规程 SSR标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 玉米丝黑穗病 maize head smut 由丝轴黑粉菌（ Sphacelotheca reiliana (Kü hn) Clint. ）侵染所引起的玉米真菌性病害 。 3.2 标记辅助选择 利用与目标性状紧密连锁的分子标记对目标性状进行选择的育种技术。 3.3 多标记组合 与育种目标性状紧密连锁的 2个及以上的分子标记组合。 3.4 前景选择标记 用于检测目标性状的分子标记。 3.5 背景选择标记 用于检测试验材料遗传背景的分子标记。 4 仪器 4.1 DNA提取仪器 研钵、核酸提取磨样机、水浴锅、移液器、低温高速离心机和通风橱等。 4.2 PCR检测仪器 DB23/T 3529 —2023 2 PCR仪、移液器、电泳仪、电泳槽和凝胶成像系统。 5 育种材料 5.1 受体亲本 选取农艺性状优良但感或高感丝黑穗病的玉米自交系，且不具有 bin2.09主效抗病位点 /基因和 bin8.03次主效抗病位点的玉米自交系，作为感病受体亲本（ P1）。 5.2 供体亲本 选取在田间表现为高抗丝黑穗病，且具有 bin2.09主效抗病位点 /基因和bin8.03次主效抗病位点的 玉米自交系，作为抗病供体亲本（ P2）。 6 育种程序 6.1 杂交 以P1为母本，以 P2为父本，人工授粉杂交，获得 F1代杂交种子。 6.2 回交 以F1为母本，以 P1为父本，人工授粉杂交，获得 BC1F1世代杂交种子。 6.3 BC1F1基因分型 6.3.1 采样 BC1F1世代杂交种子样品可以是种子的胚乳、幼苗的叶片等可用于 DNA提取的玉米植物组织。样品采 集后立刻用于 DNA提取或冷冻保存。采样时应记录每个样品名称、样品编号、采样地点和时间等。 6.3.2 DNA提取 按照NY/T 1432 -2014中9.2的要求进行。 6.3.3 前景选择 6.3.3.1 标记信息 使用的分子标记为玉米抗丝黑穗病 bin2.09主效和bin8.03次主效QTL所在位点的连锁标记或抗病基 因的功能标记，见附录 A。 6.3.3.2 PCR扩增和酶切 采用20 μL 的反应体系。 单标记反应体系包含 dNTP (2.5 mM/mL)2 μl，10×Taq Buffer 2 μl， 25 mM MgCl2 1 μl，Primer-F(20 μM) 0.5 μl，Primer-R(20 μM) 0.5 μl，Taq (5 U/μL) 1 μl， DNA(20 ng/μL~50 ng/μL) 2 μl，ddH2O 11 μl。扩增反应条件为： PCR 程序为95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共34个循环； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 单标记PCR产物酶切反应体系 10 μl，包括10×NEBuffer 1 μl，限制性内切酶 (10U/μl) 0.4 μl， PCR产物 2.5 μl，ddH2O 6.1 μl，37 ℃孵育3 h左右。 DB23/T 3529 —2023 3 6.3.3.3 酶切产物检测 对酶切产物采用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳， 如个体携带抗病位点或基因， LSdCAP2、LSdCAP3、 LSdCAP8和DNdCAPS8.03 -1标记酶切产物大小分别为 73/20 bp，22/114 bp，19/113 bp和114/23 bp，可 选取同时携带 4个抗病位点或基因的个体。 6.3.3.4 背景选择 对入选个体进行遗传背景分析，使用的分子标记为 SSR标记，见NY/T 1432 -2014中附录C。筛选遗传 背景与P1基因型相似度最高的个体。 6.4 BC1F1回交 以从6.3中获得的 BC1F1为母本，以 P1为父本，人工授粉杂交，获得 BC2F1杂交种子。 6.5 BC2F1基因分型 按照6.3的基因分型方法执行，筛选同时含有 4个抗病位点或基因、遗传背景与 P1基因型相似度最高 的个体。 6.6 BC2F1回交 以从6.5中获得的 BC2F1为母本，以 P1为父本，人工授粉杂交，获得 BC3F1杂交种子。 6.7 BC3F1基因分型 按照6.3的基因分型方法执行，筛选同时含有 4个抗病位点或基因、遗传背景与 P1基因型相似度最高 的个体。 6.8 BC3F1自交 从6.7中获得的 BC3F1自交，混收，获得 BC3F2种子。 6.9 BC3F2基因分型 按照6.3的基因分型方法执行，筛选同时含有 4个纯合抗病位点或基因、遗传背景与 P1基因型相似度 最高的个体。将 BC3F2单株种植于田间，选取农艺性状与 P1接近的单株。 6.10 选系 将6.9中获得的单株进行自交至 BC3F4代，从中选择农艺性状与 P1相似的材料进行系选，丝黑穗病抗 性鉴定按照 NY/T 1248.3 -2006的要求执行，通过小区品比试验，选出优良抗病玉米自交系。 7 田间档案 应建立田间档案，内容包括样品编号、材料名称、来源、发病株率（ %）、抗性评价及调查日期等。 DB23/T 3529 —2023 4 A A 附录 A （规范性） dCAPS分子标记信息 dCAPS分子标记信息见表 A.1。 表A.1 dCAPS分子标记信息 序 号 标记名称 标记类型 QTL所在的 染色体位置 QTL表型贡 献率（ %） 标记信息 引物 退火温度 内切酶 酶切位点 预期产物 大小 SNP 位置 突变 位点 1 LSdCAP2 连锁标记 2.09 36 上游 TACATTGATATTTGCCACACGAAT 55 PstI 5’CTGCAG 3’ 3’GACGTC 5’ 93/73,20 69 T/C 下游 CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA 2 LSdCAP3 连锁标记 2.09 36 上游 GGCTGCGCCGTGAGATACT 55 BsrI 5’ACTGGN 3’ 3’TGACCN 5’ 136/22,114 20 T/G 下游 GCTCTCGATCTGTCCTT