ICS13.060.99 CCSZ10DB21 辽宁省地方标准 DB21/T3794—2023 水质底栖动物鉴定DNA条形码法 WaterQuality—IdentificationofMacrobenthos—DNABarcoding 2023-08-30发布 2023-09-30实施 辽宁省市场监督管理局发布 DB21/T3794—2023 I目次 前言................................................................................II 1范围.................................................................................1 2规范性引用文件.......................................................................1 3术语和定义...........................................................................1 4缩略语...............................................................................2 5方法原理.............................................................................3 6试剂和材料...........................................................................3 7仪器和设备...........................................................................4 8样品.................................................................................4 9分析步骤.............................................................................4 10结果计算............................................................................7 11质量保证与质量控制..................................................................7 12废物处理............................................................................8 13注意事项............................................................................8 附录A（资料性）序列搜索与比对........................................................9 附录B（资料性）进化树的构建与遗传距离的计算.........................................11 参考文献...........................................................................13 DB21/T3794—2023 II前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省生态环境厅提出并归口。 本文件起草单位：辽宁省生态环境监测中心。 本文件主要起草人：丁振军、李杨、姜永伟、王星蒙、问青春、王秋丽、张爽、胥学鹏、张峥、卢 雁。 本文件为首次发布。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省生态环境厅（辽宁省沈阳市浑南区双园路30甲），联系电话： 024-62788591。 文件起草单位通讯地址：辽宁省生态环境监测中心（辽宁省沈阳市浑南区双园路30甲-3），联系电 话：024-62780471。 DB21/T3794—2023 1水质底栖动物鉴定DNA条形码法 警告：EB溶液具有遗传毒性，操作时应按规定要求佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。 1范围 本文件规定了利用DNA条形码技术鉴定底栖动物的方法。 本文件适用于河流、湖泊和水库中底栖动物的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T30989高通量基因测序技术规程 HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物 T/CSES81淡水生物监测环境DNA宏条形码法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 底栖动物macrobenthos 指生活史的全部或至少一个时期栖息于水体底部或底部基质中的不能通过0.5mm（40目）孔径网 筛的无脊椎动物。 [来源：HJ710.8-2014，3.2，有修改] 3.2 细胞色素c氧化酶亚基IcytochromecoxidasesubunitI，COI 后生动物线粒体基因组上的线粒体细胞色素c氧化酶亚基I对应的DNA序列。 [来源：T/CSES81-2023，3.7，有修改] 3.3 引物primer 在DNA复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的，具有一定长度 和顺序的寡核苷酸链。 [来源：GB/T30989-2014，3.11] 3.4 退火annealing 模板双链DNA经热变性、双螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到特定温度，使引物与该模板DNA DB21/T3794—2023 2单链重新配对，形成新的双链分子的过程称为退火。 3.5 聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR 模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与模板DNA两条链上 的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延伸，如 此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。 [来源：GB/T30989-2014，3.14] 3.6 降落PCRtouchdownPCR，TDPCR 一种退火温度逐渐降低的多循环PCR反应程序。由于前期退火温度高，引物结合难度增大，错配几 率降低，目的片段的产率较低但准确率较高。后期随着退火温度的降低，前期积累的正确目的片段会被 大幅扩增，使最终产物中目的片段的特异性大幅提高。 3.7 序列比对sequencealignment 指运用特定的算法检测两个或多个序列之间的相似性，用于发现生物序列中的功能、结构和进化的 信息。 3.8 遗传距离geneticdistance 遗传距离指不同的种群或种之间的基因差异的程度，并以数值进行度量。 3.9 生物大分子序列比对搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST 一种基于局部比对算法的搜索工具，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对， 获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。 3.10 分子进化遗传分析工具MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，MEGA 一种用于分析物种亲缘关系、分子功能、遗传进化等的工具。可以实现序列比对和调参建树等功能。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EB——溴化乙锭（Ethidiumbromide） DNA——脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） COI——细胞色素氧化酶亚基I（cytochromecoxidasesubunitI） PCR——聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） BLAST——生物大分子序列比对搜索工具（BasicLocalAlignmentSearchTool） MEGA——分子进化遗传分析工具（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis） DB21/T3794—2023 35方法原理 酚作为蛋白质变性剂使蛋白质变性，SDS将细胞裂解，蛋白酶K消化蛋白质成多肽，使DNA从蛋白 质中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂，离心后有机相在下层，DNA存在于上层水相中，蛋白 质则沉淀于两相之间，从而分离得到总DNA。PCR反应可特异性的扩增正向引物和反向引物间的序列， 经35次循环，目标COI序列可被扩增约235倍。与DNA结合的EB会被紫外光激发发出强烈的橙红色荧 光，比未结合的EB荧光强度高几十倍，从而扩增的COI序列可被检测到。获得的COI序列经测序在NCBI 或BOLD等公共数据库中搜索相似序列。将测序结果与搜索得到的序列一起绘制NJ进化树并计算遗传距 离