ICS 65.120 CCS B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T13093—2023 代替GB/T13093—2006 饲料中细菌总数的测定 Determination of bacterial count in feeds 2024-03-01实施 2023-08-06发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T13093—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T13093—2006《饲料中细菌总数的测定》，与GB/T13093—2006相比，除结构调 整和编辑性改动外，主要技术变化如下： a) 更改了适用范围（见第1章，2006年版的第1章）； b) 更改了原理（见第4章，2006年版的第4章）； c) 更改了培养基（见5.7，2006年版的第6章）； d) 删除了试样的制备（见2006年版的第7章） e) 增加了样品（见第7章）； f) 删除了测定程序（见2006年版的第8章）； 增加了空白试验（见8.1.2.3)； g) h) 更改了培养条件（见8.2，2006年版的9.1.5）； i) 更改了菌落计数（见8.3，2006年版的9.2)； 更改了试验数据处理（见第9章，2006年版的9.3）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院北京畜牧兽医 研究所。 本文件主要起草人：李丽蓓、谢秀兰、刘晓露、娄迎霞、李征、姚婷、董雪、崔婕、樊霞。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： 1986年首次发布为GB/T13093一1986，1991年第一次修订，2006年第二次修订； 一本次为第三次修订。 1 GB/T13093—2023 饲料中细菌总数的测定 1范围 本文件描述了检测饲料中细菌总数的平板计数法 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细菌总数bacterial count 饲料试样经过处理，在一定条件下（如用特定的培养基、培养温度和时间等）培养后，所得每克或每 毫升试样中菌落的数量。 注：菌落的数量以菌落形成单位（colonyformingunit，CFU）表示。 4原理 接种平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中 C 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯的试剂。 5.1水：GB/T6682，三级。 5.2氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取20g氢氧化钠，溶于水，冷却至室温后，用水定容至500mL。 5.3盐酸溶液（1mol/L）：量取42mL的浓盐酸，用水稀释至500mL，摇匀。 5.4磷酸盐缓冲储备液：称取34.0g磷酸二氢钾溶解于500mL水中，用大约175mL的1mol/L氢氧 化钠溶液调节pH至7.2后，用水稀释至1000mL,混勾2℃~8℃存放。 5.5无菌磷酸盐缓冲液：取磷酸盐缓冲储备液（5.4)1.25mL，用水稀释至1000mL，分装适宜容器或每 管9mL，121℃高压灭菌15min。 1 GB/T13093—2023 5.6 5无菌生理盐水：称取氯化钠8.5g，用水溶解并定容至1000mL，分装适宜容器或每管9mL， 121℃高压灭菌15min。 5.7平板计数琼脂培养基：按照附录A制备。 5.8无菌液体石蜡：取液体石蜡，121℃高压灭菌20min。 5.9无菌吐温80：取吐温80，121℃高压灭菌20min。 6仪器设备 6.1恒温培养箱：控温精度士1℃。 6.2拍打式均质器。 6.3 恒温装置：控温精度土2℃。 6.4高压灭菌器。 6.5天平：感量0.1g和0.01g。 6.6pH计或精密pH试纸。 6.7无菌均质杯或无菌均质袋。 6.8无菌移液管或微量移液器及吸头：lmL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。 6.9无菌试管。 6.10无菌培养皿：直径90mm。 7样品 按照GB/T20195进行样品制备，磨碎，过0.45mm孔径筛。样品应尽快检验。 8试验步骤 8.1试样溶液的制备和稀释 8.1.1试样溶液的制备 8.1.1.1普通试样：以无菌操作称取25g（mL）试样，放于含有225mL无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理 盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放人盛有225mL稀释液的无 菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1min～2min，制成1：10的试样匀液。 8.1.1.2油脂类试样：以无菌操作称取25g（mL）试样，先加12.5mL无菌液体石蜡混匀，再加25mL 无菌的吐温80.在40℃44℃水浴中振荡混合10min，加人无菌的生理盐水187.5mL（在40℃～ 44℃水浴中预温），在40℃44℃水浴中乳化，制成1：10的试样匀液， 8.1.2试样溶液的稀释 8.1.2.1用1mL无菌移液管或微量移液器吸取1：10试样匀液1mL，沿管壁慢慢注人含有9mL无 菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，或放微 型混合器上，混合30s，制成1：100的试样匀液。 8.1.2.2按8.1.2.1操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次应更换一次无菌移液管或微量移 液器吸头。 8.1.2.3根据对试样污染状况的估计，选择2个～3个适宜连续稀释度的试样匀液，每个稀释度吸取 1mL试样匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平血。同时，吸取1mL无菌磷酸盐缓冲液或无菌生 2 GB/T13093—2023 理盐水置于无菌平皿内做空白对照。 8.2培养 装置）倾注平血，小心转动平血使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不超过 30min。如果估计试样可能在培养基表面弥漫生长时，待培养基完全凝固后，可在凝固后的琼脂表面覆 盖一薄层凉至48℃土2℃平板计数琼脂培养基（约4mL）。待琼脂凝固后，水平倒置平板于36℃土1℃ 恒温培养箱内培养48h土2h。 8.3细菌菌落计数 8.3.1细菌菌落计数时，可用肉眼观察，必要时可借助于放大镜或菌落计数器检查，以防遗漏。细菌计 数以菌落形成单位（CFU)表示。 8.3.2选择菌落数在30CFU～300CFU之间，无蔓延菌落生长的平板计数。低于30CFU的平板记 录具体菌落数，大于300CFU的可记录成多不可计。 8.3.3两个平板其中一个平板有较天片状菌落生长时，应选择无较大片状菌落生长的平板进行菌落计 数；若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，则应选择菌落分布均匀的半个平板进行 菌落计数，计数结果乘以2代表这个平板的菌落数。 8.3.4若平板上出现菌落间无明显界线的链状生长，则将每条单链作为一个菌落计数。 8.3.5若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 9试验数据处理 9.1细菌总数的计算 9.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平 均值乘以相应稀释倍数，作为每克或每毫升试样中细菌总数结果，见附录B中示例1。 9.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： Zc .......(1 式中： N样品中细菌总数； C——平板(含适宜范围的平板)菌落数； 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2 第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d一稀释因子(第一稀释度)。 计算结果作为每克或每毫升试样中细菌总数结果，见附录B中示例2。 9.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均天于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可 记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算，见附录B中示例3。 9.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算，见附录B中示例4。 9.1.5若所有稀释度平板均无细菌生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算，见附录B中示例5。 9.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于 300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算，见附录B中示例6。 3 GB/T13093—2023 9.2 结果表述 9.2.1 细菌总数小于100CFU时，按“四舍五人”原则修约，以整数报告。 9.2.2细菌总数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入原则修约，取前2位数字，后面用 0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按照“四舍五入原则修约后，采用2位有效数字。 4 GB/T13093—2023 附录A （规范性） 平板计数琼脂培养基制备 A.1 培养基成分 培养基成分见表A.1。 表A.1 培养基成分 成分 质量或体积 胰蛋白陈/g 5.0 酵母浸膏（浸粉）/g 2.5 葡萄糖/g 1.0 琼脂/g 15.0 三级水/mL 1 000 A.2 制法 将上述成分煮沸溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7.0土0.2。分装至三角瓶 或试管中，121℃高压灭菌