ICS 65.020.01 B 16 备案号：60274-2019 内 蒙 DB 15 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1491—2018 油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌检测方法 Detection methods for Pseudomonas syringae pv. maculicola in Rapeseed(Seeds) 2018-09-30 发布 内蒙古自治区质量技术监督局 2018-12-30 实施 发布 DB15/T 1491—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由二连浩特出入境检验检疫局技术中心提出。 本标准由内蒙古自治区质量技术监督局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国二连浩特出入境检验检疫局技术中心、中华人民共和国南海出入 境检验检疫局技术中心、中华人民共和国满洲里出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人：袁淑珍、张永宏、张志峰、李凯兵、刘玮琦、魏宇虹、李菁雯。 I DB15/T 1491—2018 油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌检测方法 1 范围 本标准规定了油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌的鉴定、检测结果判定等要求。 本标准适用于油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌的检测方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细菌性黑斑病菌 Bacterial black spot 学名: Pseudomonas syringae pv．Maculicola，简称PSM。 中文名:丁香假单胞杆菌斑生致病变种。 该病菌属于原核生物界Procaryotae，薄壁菌门Gracilicutes，假单胞菌科Pseudomonadaceae。 4 病菌的鉴定 4.1 PCR 初筛 4.1.1 样品 DNA 提取 从油菜籽(种子)样品中取200 g用作检测样品。在样品中加入350 mL生理盐水，4 ℃浸泡过夜；纱 布过滤，滤液10000 r/min离心15 min，1 mL灭菌水悬浮沉淀，转入EP管12 000 r/min离心5 min，沉淀 用于提取DNA。用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。重复3次。 4.1.2 PCR 检测 分别取2 µL样品DNA，检测hrpZ基因和冠毒素基因，分别进行PCR扩增。用十字花科黑斑病菌标准 菌株DNA作阳性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照。 hrpZ基因检测引物MM5F(5'-gaacgagctgaaggaagaca-3')//5R(5'-cagcctggttagtctggtta-3')，预期扩增产物 532 bp；冠毒素基因检测引物cfl F(5'-ggcgctccctcgcactt-3')//R(5'-ggtattggcgggggtgc-3')，预期扩增产物670 bp。 PCR反应体系：PCR反应总体积为30 µL，包含：10 mmol/L Tris-HCl；50 mmol/L KCl（pH 8.3）； 1.5 mmol/L MgCl2；dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为100 µmol/L；引物浓度各为100 nmol/L；模板 1 DB15/T 1491—2018 DNA为2 µL；1.5 U Taq DNA聚合酶。反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃（引物cfl F/R为67 ℃） 30 s，72 ℃ 45 s，循环35次；最后57 ℃ 5 min。 4.1.3 电泳分析 扩增产物电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。 取10 μ L扩增产物与3 μ L 6×上样缓冲液混合均匀，在1.5 %琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中(4 V-6 V/cm)电泳30 min，核酸染料染色后凝胶成像系统分析。如果PCR初筛结果2对引物扩增均为阳性，需继 续以下验证。 4.2 分离培养 4.2.1 菌悬液制备 如油菜籽(种子)样品PCR初检为阳性，另取样品50 g，加入100 mL 生理盐水，4 ℃浸泡过夜；纱布 过滤，滤液10000 r/min离心20 min，1 mL灭菌水悬浮沉淀，沉淀悬浮液10倍系列稀释备用。 4.2.2 病原菌分离 分别取稀释10倍、100倍和1000倍菌悬液各100 μ L涂布MT培养基平板，每个稀释度10次重复。MT 平板置于26 ℃培养箱内培养3 d ~ 4 d，挑取疑似菌落在KB培养基上纯化三次用于后续检测。 4.3 菌落特征鉴定 油菜籽(种子)提取液在MT培养基上培养3 d后，PSM的典型菌落特征为乳白色，圆形至椭圆形，表面 干扁；菌落周围无透明水解圈。培养4 d ~7 d后，菌落周围出现小而模糊的水解圈。 4.4 PCR 检测和产物序列分析 对疑似菌落在KB培养基上纯化后，无菌水洗脱，取菌液1 mL，12000 r/min离心5 min，收集菌体， 用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。按照4.1.2中的方法进行PCR 检测。扩增产物约为307 bp，测序结果与 GenBank中PSM菌株和相关菌株做序列相似性比对分析。 4.5 致病性测试 选取与PSM菌落形态特征相符且PCR检测阳性的分离物，用无菌水配成108 CFU／mL的菌悬液，无菌 棉签蘸取菌悬液均匀涂布接种四周龄健康油菜幼苗嫩叶，以无菌水作为对照，幼苗接种后保湿24 h，之 后转入20 ℃光照培养箱内培养，7 d后观察发病情况，对接种发病幼苗叶片进行病原菌的再分离、纯化， 并与最初的接种物进行比较。 5 结果判定 分离物培养后，根据菌落形态特征、PCR检测结果、序列分析的结果，进行结果判定。若4.1PCR初 筛和4.4病菌的分离物PCR检测为阳性，且形态特征符合4.3中描述，可判定为十字花科黑斑病菌 Pseudomonas syringae pv. maculicola。 2 DB15/T 1491—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 主要试剂和仪器设备 A.1 主要试剂 蒸馏水、0.5 %次氯酸钠； 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682的规定； PBS 缓冲液: NaCl 8. 10 g、NaH2PO4 0. 18 g、Na2HPO4 1. 97 g、蒸馏水1000 mL，pH 7. 4； 细菌基因组DNA提取试剂盒； PCR试剂：商用PCR试剂，包括PCR buffer，dNTP，Taq酶； 凝胶电泳试剂：包括琼脂糖，TAE Buffer，Loading Buffer，EB。 A.2 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、核酸测定仪、PCR仪、凝 胶成像系统、电泳仪、培养箱和植物生长箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。 3 DB15/T 1491—2018 BB 附 录 B （资料性附录） 培养基 B.1 MT（Milk TweenMT）培养基 胰蛋白胨10g、无水氯化钙0.25g、酪氨酸0.5g、琼脂粉15g、脱脂奶粉10g、制霉素40mg、头孢氨苄 80mg、盐酸万古霉素10mg、无菌吐温-80 10mL和灭菌水1000 mL； B.2 KB(King’S medium B)培养基 H2O 1000 ml、蛋白胨20.0 g、甘油10.0 ml、K2HPO4 1.5 g、MgSO4.7H2O 1.5 g、琼脂15.0 g、KOH 调PH值7.2； B.3 NA( Nutrient Agar）培养基 酵母粉1 g、牛肉浸膏3 g、蛋白胨5 g、蔗糖10 g、琼脂17 g、水1000 mL。 以上培养基均于121 ℃高压蒸气灭菌20 min后保存于室温。 4 DB15/T 1491—2018 CC 附 录 C （资料性附录） 十字花科细菌性黑斑病菌基本信息 C.1 病原菌 十字花科细菌性黑斑病是由丁香假单胞杆菌斑生致病变种（Pseudomonas syringae pv．Maculicola， 简称PSM）引起的十字花科作物重要种传病害。该病菌短杆状，大小为 1.3 μm ~ 3.0 μm×0.7 μm ~ 0.9 μm， 有 1~ 5 根极生鞭毛，革兰氏染色为阴性。 C.2 寄主植物 寄主主要是十字花科植物，如白菜Brassica pekinensis Rupr.、花椰菜Brassica oleracea L. var. botrytis L.、萝卜Raphanus sativus L.等，同时也可危害辣椒Capsicum annuum L.、番茄Lycopersicon esculentum Mill. 。1911年McCulloch首次报道该病菌在花椰菜上，随后在芥菜Brassica juncea (L.) Czern. et Coss.、 芜菁Brassica rapa var. rapa、油菜 Brassica napus L.等超过25种十字花科植物上陆续发现了该病菌的危 害。 C.3 分布 该病菌广泛分布于世界各地。如美国、英国、法国、澳大利亚和阿根廷等国。2002年，该病菌引起 的萝卜细菌性黑斑病在我国湖北省长阳县高山蔬菜基地爆发流行，造成较大经济损失。2007年该病菌被 列为《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。目前，国内局限分布于浙江、湖北、湖南、云 南和广东等省。 C.4 传播途径 病菌主要在种子上或土壤及病残体上越冬，在土壤中可存活1年以上，主要在莲座期至结球期侵染。 病菌可通过灌溉水、雨水或昆虫带菌侵染。 C.5 病原形态及生物学特征 在肉汁胨琼脂平面上菌落平滑有光泽， 白色至灰白色，边缘为光滑圆形，质地均匀，后具皱褶。 在KB培养基上产生蓝绿色的荧光。该菌在0℃~32℃均可生长，以24℃~25℃最适，致死温度49℃，适应 pH6.1~8.8，最适pH为7，对氨苄青霉素尤其敏感。十字花科黑斑病菌种子提取液在MT培养基上培养3d 后，PSM的典型菌落特征为菌落乳白色，圆形至椭圆形，表面干扁；菌落周围无透明水解圈。培养4d ~ 7d后，菌落周围出现小而模糊的吐温80水解圈，与大而透明的酪蛋白水解圈差异明显。见图C.1。 C.6 典型症状 5 DB15/T 1491—2018 该病菌主要危害十字花科蔬菜的叶、茎和荚。病菌感染叶片时先在叶片上形成1 mm大小的水浸状小 斑点，最初为暗绿色，扩展后呈3mm~4mm不规则形，淡褐色、边缘紫褐色病斑，斑点多发生在气孔处， 因受叶脉限制表现为角斑，病斑中间色深发亮具油光状，数个病斑常融合成不规则坏死大斑，严重的叶 脉变褐，叶片变黄脱落