ICS 67.120.10 B 43 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB 12/ T527—2014 奶牛结核病净化技术规范 The technical standard for cleaning of Bovine Tuberculosis in dairy cattle 2014 - 08 - 04 发布 天津市市场和质量监督管理委员会 2014 - 09 - 01 实施 发 布 DB12/T 527—2014 前 言 本标准的编写符合GB/T 1.1-2009的要求。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由天津市畜牧兽医局提出。 本标准起草单位：天津市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：刘建文、任景江、徐继鹏、王志成、孙涛、李洁、刘莹、曹建新。 I DB12/T 527—2014 奶牛结核病净化技术规范 1 范围 本规范规定了奶牛结核病净化的术语和定义、检测方法、净化措施、净化群（场）的认定、净化群 （场）的维持。 本规范适用于从事奶牛饲养的单位和个人。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 16548 -2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术 《牛结核病防治技术规范》（农业部，农医发［2007］12号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛结核病 Bovine Tuberculosis（BTB） 牛结核病（Bovine Tuberculosis, BTB）是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人兽共 患的慢性传染病。 3.2 净化 Cleaning 对某病发病地区采取一系列措施，达到消灭和清除传染源的目标。 3.3 变态反应 Allergy Reaction 变态反应也叫超敏反应，是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时，发生的一种 以机体生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的特异性免疫应答。 3.4 γ-干扰素 Interferon Gamma（IFN-γ） 1 DB12/T 527—2014 γ-干扰素是指主要由淋巴细胞（如自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、CD4 Th1和CD8 T淋巴细胞、 效应T细胞）分泌的促炎性细胞因子。 4 检测方法 4.1 牛型结核分枝杆菌 PPD（提纯蛋白衍生物）皮内变态反应试验（即牛提纯结核菌素皮内变态反应 试验）按 GB/T 18645-2002 规定操作。 4.2 γ-干扰素 ELISA 试验作为牛型结核分枝杆菌 PPD 皮内变态反应试验的补充试验（见附录 A）。 5 净化措施 5.1 检测 5.1.1 成年牛每年春秋两季各进行一次检测。 5.1.2 对奶牛群（场）存栏奶牛按 100%比例进行检测。 5.1.3 初生犊牛应于 20 日龄时进行第一次检测，100～120 日龄时，进行第二次检测。 5.1.4 检测时，首先用牛型结核分枝杆菌 PPD 皮内变态反应试验进行检测。 5.1.5 凡牛型结核分枝杆菌 PPD 皮内变态反应试验阳性或疑似反应者， 应 3 d 后进行γ-干扰素 ELISA 试验检测，如γ-干扰素 ELISA 试验为阳性，按照本规范 5.3 规定处理；如为阴性，间隔 3 个月进行复 检。 5.1.6 连续两次检测均为阴性者视为阴性牛。 5.2 隔离 牛型结核分枝杆菌 PPD 皮内变态反应试验和γ-干扰素反应试验结果阳性或可疑牛须与受威胁的 同群牛隔离，隔离场地周围应有自然屏障或人工栅栏。 5.3 阳性牛的处理 5.3.1 扑杀 对确认的结核病阳性牛全部扑杀。 5.3.2 无害化处理 扑杀的结核病阳性牛，应按照 GB 16548-2006 进行无害化处理。 5.4 消毒 5.4.1 紧急消毒 奶牛群中检出并剔出结核病阳性牛后，对污染的场所、用具、物品进行严格消毒。 饲养场的金属设施、设备采取火焰、熏蒸等方式消毒；饲养场的圈舍、场地、车辆等，可选用 2%烧碱 等有效消毒药消毒；饲养场的饲料、垫料可采取深埋发酵处理或焚烧处理；粪便采取堆积密封发酵方式， 以及其他相应的有效消毒方式。 5.4.2 日常消毒 饲养场及牛舍出入口处，应设置消毒池，内置有效消毒剂，如 3%～5%来苏儿溶液 或 20％石灰乳等。消毒药要定期更换，以保证一定的药效。牛舍内的一切用具应定期消毒；产房每周 进行一次大消毒，分娩室在临产牛生产前及分娩后各进行一次消毒。 5.5 引种 2 DB12/T 527—2014 5.5.1 异地调运的奶牛，必须来自于非疫区，应当符合农业部规定的健康标准。 5.5.2 跨省、自治区、直辖市引进奶牛及其胚胎和精液，应按《跨省调运乳用种用动物产地检疫规程》 向输入地动物卫生监督机构申请办理审批手续。 5.5.3 检疫合格的奶牛经市人民政府指定通道进入，运输工具应接受防疫消毒。调入后应按农业部《动 物检疫管理办法》相关规定隔离饲养 30 d，经隔离检疫合格的方可混群饲养。 5.5.4 进口奶牛及其胚胎和精液，按照《进境动植物检疫审批管理办法》须向国家质检总局提出申请， 办理审批手续，经检疫合格入境后，需隔离 45 d，经检疫合格方能入关。 5.6 从业人员 从事奶牛饲养和管理的人员每年要进行健康检查，发现患有结核病的应调离岗位。 6 净化群（场）的认定 奶牛群（场）同时满足以下要求，认定为达到净化标准。 6.1 连续 2 年以上无临床病例。 6.2 按本规范 5.1 的规定连续 2 次以上全群检测结果均为阴性。 6.3 引进奶牛及其胚胎和精液的，符合本规范 5.5 的规定。 7 净化群（场）的维持 7.1 达到净化标准的奶牛群（场）每年进行检测。 7.2 发现阳性牛按照本规范 5.3 规定处理，同群牛按本规范 5.1.2 要求检测。 7.3 按本规范 5.5 规定对异地调运奶牛进行检疫。 7.4 按本规范 5.4.2 规定做好日常消毒。 7.5 按本规范 5.6 规定做好从业人员管理工作。 3 DB12/T 527—2014 附 录 A （资料性附录） γ-干扰素 ELISA 试验 A.1 试验材料 A.1.1 牛结核分枝杆菌γ-干扰素ELISA试剂盒（内含酶标板、牛γ-干扰素阳性对照、牛γ-干扰素阴 性对照、血浆稀释缓冲液、20倍浓缩洗液、100倍浓缩酶标结合物、5倍浓缩酶标结合物稀释液、底物缓 冲液、100倍浓缩的显色剂溶液和终止液） A.1.2 牛型提纯结核菌素（牛型PPD） A.1.3 禽型提纯结核菌素（禽型PPD） A.1.4 肝素钠真空管 A.1.5 孔组织培养板 A.1.6 A.1.7 A.1.8 单道可调移液器及配套吸头（20µL-200µL、100µL-1000µL、1mL-10mL） 道移液器及配套吸头（50µL-300µL） 量筒（100mL、1L、2L） A.1.9 有盖离心管（1.5 mL） A.1.10 恒温CO2培养箱 A.1.11 酶标仪 A.1.12 洗板机 A.2 试剂配制 A.2.1 磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 M pH7.2) 取磷酸氢二钠 1.096 g、磷酸二氢钠 0.316 g、氯化钠 8.5 g， 用蒸馏水定容至 1000 mL，调 pH 至 7.2，灭菌后使用。 A.2.2 酶标结合物 用去离子水或蒸馏水重新溶解 100 倍浓缩的冻干酶标结合物。 A.2.3 酶标结合物稀释液 用去离子水或蒸馏水重新溶解5倍浓缩的酶标结合物稀释液。 A.2.4 牛γ-干扰素阳性对照 用1 mL去离子水或蒸馏水重新溶解。 A.2.5 牛γ-干扰素阴性对照 用1 mL去离子水或蒸馏水重新溶解。 A.2.6 洗液 用去离子水或蒸馏水重新溶解20倍浓缩的洗液。 A.2.7 显色剂溶液 将100倍浓缩的显色剂溶液用底物缓冲液做100倍稀释配制。 A.3 试验方法 A.3.1 临床样本采集及预处理 A.3.1.1 样本的采集 牛静脉无菌采血5 mL，放入肝素钠真空管中，轻轻颠倒几次混合血液，形成肝 素钠抗凝全血。出现凝血的全血样品不可用。 A.3.1.2 肝素钠抗凝全血的运送 肝素钠抗凝全血应在周围环境温度（22±5）℃运送，并且最好在采 血后8 h（最长不超过30 h）内用于检测。 A.3.1.3 定量吸取肝素钠抗凝全血 分装前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。将抗凝血加入24 孔组 织培养板，每份抗凝血样品加3孔，每孔加1.5 mL。 A.3.1.4 加入牛型PPD、禽型PPD和PBS 向24 孔培养板中每份样品对应的3个孔分别无菌加入100 μL 牛型PPD、禽型PPD 和PBS（阴性抗原对照） ，充分混匀。 A.3.1.5 全血孵育过夜 将全血培养板置CO2培养箱内，37 ℃孵育18 h（全血可接受培养时间为16～ 4 DB12/T 527—2014 24 h）。 A.3.1.6 收获血浆 经过18 h 培养，用移液器小心吸取约400 μL 的上层血浆， 转入独立的1.5 mL 离 心管中，待测。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。待测样品可立即用于试验或-20 ℃冷冻贮存。 A.3.2 检测方法 A.3.2.1 试验前将酶标板和所有试剂恢复到室温，试剂充分混匀。 A.3.2.2 向酶标板中的96孔中分别加入50 μL血浆稀释缓冲液， 再向相应孔中加入50 μL 待测样品和 牛γ-干扰素阴、阳性对照样品。对照样品应最后加入。充分振荡1min，彻底混匀。封板，室温［ （22 ±5）℃］孵育［（60±5）min］。用洗板机洗涤6 次， 将酶标板放在干净的滤纸上拍打几次，尽量除 去残留的洗液。 A.3.2.3 每孔加入100 μL稀释好的酶标结合物，充分振荡混匀。室温孵育（60±5 min），洗涤6 次。 A.3.2.4 每孔加入100 μL 新鲜配制的显色剂溶液，充分振荡混合。室温避光孵育30 min。 A.3.2.5 迅速加入50 μL 终止液，轻轻摇动混匀。 A.3.2.6 终止后5 min 内读出OD450 值，然后用OD 450值计算结果。 A.3.3 结果判定 A.3.3.1 满足以下2个条件试验方成立 牛γ-干扰素阴性对照OD450 值<0.13，且阴性对照重复孔OD450 值差≤0.04；牛γ-干扰素阳性对照OD450 值>0.7。 A.3.3.2 计算每头动物所有样品（包括加入牛型PPD、禽型PPD 和PBS） 的OD450 值 阳性=牛型PPD的OD450 值-禽型PPD的OD450 值≥0.1，且