书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜２ １ ２ ０—２ ０ １ ４ 代替Ｓ Ｎ／Ｔ２ １ ２ ０—２ ０ ０ ８ 流行性溃疡综合症检疫技术规范 犙狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 狆狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犲 狆犻 狕 狅 狅 狋 犻 犮狌 犾 犮 犲 狉 犪 狋 犻 狏 犲狊 狔狀 犱 狉 狅 犿 犲 ２ ０ １ ４１ １１ ９发布 ２ ０ １ ５０ ５０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本标准代替 Ｓ Ｎ／Ｔ２ １ ２ ０—２ ０ ０ ８《流行性溃疡综合症检疫技术规范 》 。本标准与 Ｓ Ｎ／Ｔ２ １ ２ ０—２ ０ ０ ８相比，主要技术变化如下 ： — — —增加了采样 ； — — —增加了临床症状 ； — — —对诱导次级游走孢子进行了修改 ； — — —对Ｐ Ｃ Ｒ中样品的处理方法进行了修改 ； — — —对Ｐ Ｃ Ｒ试验引物进行了修改 ； — — —对Ｐ Ｃ Ｒ试验条件进行了调整和优化 ； — — —对结果判定进行了修改 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、深圳市检验检疫科学研究院 、中华人民共和国广东出入境检验检疫局 。本标准主要起草人 ：史秀杰、邱杨、于力、贾鹏、王津津、郑晓聪、刘建丽、何俊强、兰文升、刘荭、赵丽。本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： — — —Ｓ Ｎ／Ｔ２ １ ２ ０—２ ０ ０ ８。 Ⅰ犛 犖／犜２ １ ２ ０—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.流行性溃疡综合症检疫技术规范 １　范围 本标准规定了各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的病原分离 、鉴定及诊断方法 。本标准适用于各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的检疫和疫病监测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ８ ０ ８ ８ 　出入境动物检疫采样 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室　生物安全通用要求 ３　概述 流行性溃疡综合症 （Ｅｐｉ ｚ ｏ ｏ ｔ ｉ ｃＵ ｌ ｃ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｖ ｅＳ ｙｎ ｄ ｒ ｏ ｍ ｅ） ，又称红点病 （Ｒ Ｓ Ｄ） 、霉菌性肉芽肿 （ＭＧ） 、霉菌性溃疡 （ＵＭ） ，是由丝囊霉 （犃狆犺 犪 狀 狅 犿狔犮 犲 狊 犻 狀 狏 犪 犱 犪 狀 狊 或者犃．狆犻 狊 犮 犻 犮 犻 犱 犪 ）引起的野生及养殖的淡水与半咸水鱼类的季节性流行病 ，主要表现为侵入性丝囊霉感染和坏死性溃疡病变 ，特征性地引起肉芽肿性反应，简称ＥＵ Ｓ（参见附录 Ａ） 。 ４　试剂和材料 ４．１　水：用于Ｐ Ｃ Ｒ（包括核酸抽提 ）的水要用 Ｄ Ｅ Ｐ Ｃ处理，以除去ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶。其余用水应符合 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２一级水的规格 。 ４．２　丝囊霉参考株 ：由指定单位提供 。 ４．３　犜 犪狇ＤＮＡ聚合酶：－２ ０℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化 。 ４．４　ｄ ＮＴ Ｐ ｓ：含ｄ Ｃ Ｔ Ｐ、ｄ ＧＴ Ｐ、ｄ ＡＴ Ｐ、ｄ ＴＴ Ｐ各１ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ４．５　引物：两对引物 ，浓度为４ ０μｍ ｏ ｌ／Ｌ，序列为： Ａ ｉ ｎ ｖ ａ ｄ  ２ Ｆ ：５’ Ｔ ＣＡ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  Ｃ ＧＧ  ＴＧ  ３ ’ Ａ ｉ ｎ ｖ ａ ｄ  Ｉ Ｔ Ｓ Ｒ １ ：５’ ＧＧＣ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＴＴ Ｃ  ＡＧＴ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ３ ’扩增丝囊霉 Ｉ Ｔ Ｓ １ｒ ＤＮＡ 基因中的 ２ ３ ４ｂｐ的ＤＮＡ片断。 Ｉ Ｔ Ｓ １ １：５’ Ｇ Ｃ Ｃ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  Ｔ Ｃ Ｇ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＣ  ３ ’ Ｉ Ｔ Ｓ ２ ３：５’ Ｃ ＧＴ  ＡＴＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  Ｃ ＣＡ  ３ ’扩增丝囊霉 Ｉ Ｔ Ｓ １ｒ ＤＮＡ 基因中的 ５ ５ ０ｂｐ的ＤＮＡ片断。 ４．６　无水乙醇 ：分析纯，使用前预冷到 －２ ０℃。 ４．７　１ ０％福尔马林 。 ４．８　酒精：７ ０％、８ ０％、９ ５％及无水酒精 。 １犛 犖／犜２ １ ２ ０—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．９　二甲苯。 ４．１ ０　中性树脂 。 ４．１ １　石蜡。 ４．１ ２　Ｈ ａ ｒ ｒ ｉ ｓ氏苏木精染液 。 ４．１ ３　０． ５％伊红酒精溶液 。 ４．１ ４　１％盐酸酒精溶液 。 ５　器材和设备 ５．１　手术刀和镊子 。 ５．２　载玻片和盖玻片 。 ５．３　培养皿。 ５．４　恒温培养箱 。 ５．５　普通冰箱和超低温冰箱 。 ５．６　倒置显微镜 。 ５．７　研钵。 ５．８　离心机和离心管 。 ５．９　微量移液器及吸头 。 ５．１ ０　Ｐ Ｃ Ｒ扩增仪。 ５．１ １　电泳仪。 ５．１ ２　紫外观察灯或凝胶成像仪 。 ５．１ ３　标本缸。 ５．１ ４　包埋机。 ５．１ ５　切片机。 ６　流行性溃疡综合症的诊断 ６．１　病原分离鉴定的实验室环境条件 应符合Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 的要求。 ６．２　诊断原则 ＥＵ Ｓ的诊断基于出现临床症状后 ，通过患病组织病理检查观察到特征性的霉菌性肉芽肿 ，或者从患病组织分离到丝囊霉 ，经生物学或 Ｐ Ｃ Ｒ方法鉴定 。 ６．３　临床症状 病鱼体表通常出现红斑或小的溃疡 ，并进一步发展成大的溃疡性损伤 。发病早期 ，体表、头部、鳃盖和尾柄等处有红斑 ；后期发展到背部和腹侧部皮肤表面呈现大面积的红 、灰色溃疡并伴有棕红色坏死灶。高度易感鱼类其损伤更加广泛 ，身体的后半部分几乎完全腐烂 ，或其头盖骨处的软 、硬组织均坏死 ，导致鱼虽未死但脑组织却暴露在外 。 ６．４　采样 根据Ｇ Ｂ／Ｔ１ ８ ０ ８ ８ 规定的数量取样 。选取临床症状轻微 、表皮有溃疡症状或红斑的活的病鱼 。紧靠溃疡或溃疡下面的肌肉组织最适合分离卵菌 ，溃疡边缘的肌肉组织最适合做组织病理学检查 。送检 ２犛 犖／犜２ １ ２ ０—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.样品最好能保持鲜活或放在冰盒中保存 ，如果不能及时送往实验室 ，应先将鱼麻醉后浸泡于 １ ０％的福 尔马林溶液或 １ ０％的福尔马林磷酸缓冲液中固定至少 １ｄ～２ｄ，之后放入装有福尔马林浸润棉纸的双 层塑封袋中 ，密封并保持半干状态 ，运往实验室 。 ６．５　组织病理检查 取有溃疡症状或红斑的活的或濒死的病鱼 ，用１ ０％的福尔马林固定病鱼的皮肤和肌肉 （＜１ｃ ｍ３） ， 包括坏死部位的边缘和四周的组织 。固定好的组织按照常规石蜡切片方法制作切片 ，用苏木精 伊红 （Ｈ＆Ｅ）或一般的霉菌染色 （如用Ｇ ｒ ｏ ｃ ｏ ｔ ｔ’ｓ染色）后封片，显微镜下观察骨骼肌中是否有侵入性菌丝和 典型的肉芽肿 （参见图Ａ． １） 。 ６．６　丝囊霉的分离 取中等大小 ，表皮灰白有凸起损伤的病鱼 。除去病灶周边的鳞屑和表皮 ，用烧红的刀片烫灼暴露出的皮肤进行表面消毒 。用灭菌的刀片从烫灼过的部位垂直刺入到肌肉致密层 ，切下一块 ２ｍｍ３～４ｍｍ３的小块。如果鱼体长小于 ２ ０ｃ ｍ且溃疡灶在鱼腹侧面或尾柄部 ，则用刀片沿着溃疡边缘将鱼横切成两半 ，用灼烧的刀片对暴露的肌肉表面消毒 ，用无菌刀片从损伤下部切一圆形 ２ｍｍ３～４ｍｍ３的 小块。注意操作过程中工具不要碰到鱼的外表面 。将切下的组织块放到加有 １ ０ ０Ｉ Ｕ／ｍＬ青霉素和 １ ０μｇ／ｍＬ喹酸的Ｇ Ｐ肉汤（见Ｂ． ２）平皿中，在２ ５℃下培养接种物并在 １ ２ｈ内用倒置显微镜镜检 。将 出现的菌丝尖重复转移到加有 １ ０ ０Ｉ Ｕ／ｍＬ青霉素和 １ ０μｇ／ｍＬ链霉素的新鲜的 Ｇ Ｐ琼脂（见Ｂ． ３）平板 中，直到培养物纯净为止 。分离物可以于 １ ０℃下在Ｇ Ｐ琼脂平板中保存 ７ｄ，或者于２ ５℃下在ＧＹ琼 脂（见Ｂ． ４）平板中保存 １周～２周。 ６．７　丝囊霉的鉴定 ６．７．１　生物学鉴定 取６． ６中带有生长活力菌丝的一小团琼脂 （直径约３ｍｍ～４ｍｍ） ，放到含有 Ｇ Ｐ Ｙ肉汤（见Ｂ． ５）的 平皿中，于２ ０℃培养４ｄ。在５个含有灭菌池塘水的平皿中依次洗涤培养物 ，洗脱琼脂 ，再将培养物放 到新的含有灭菌池塘水的平皿中 ２ ０℃过夜。１ ２ｈ后如果能形成原代孢囊群落 ，在倒置显微镜下观察 是否有能游动的次级游动孢子 。将含１ ０ ０个游走孢子的 ０． １ｍＬ 悬液，肌肉注射 ＥＵ Ｓ易感鱼，于２ ０℃感染１ ０ｄ～１ ４ｄ。按６． ５中的方法做切片 ，显微镜下观察是否有无隔菌丝或典型的霉菌性肉芽肿 。 ６．７．２　犘 犆 犚鉴定 ６．７．２．１　犇 犖 犃的提取 ６．７．２．１．１　取６． ６Ｇ Ｐ 肉汤中分离到的菌丝 ，用Ｐ Ｂ Ｓ清洗两遍后放在棉纸上将液体吸干 ，或者用刀片刮 下Ｇ Ｐ琼脂平板表面的菌丝 ，５ ０ｍｇ～２ ５ ０ｍｇ。如果是感染组织 ，则取２ ５ｍｇ～５ ０ｍｇ。用液氮研磨后 ， 放入１