以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 65.050 C 53 2019 -12-27发布 2020 -07-01 实施出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留 量的测定　液相色谱 - 质谱 / 质谱法 Determination of amitraz and metabolites residues in royal-jelly for import and export — LC-MS/MS method SN/T 2574 —2019 代替 SN/T 2574— 2010以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 2574—2019前 言 本标准依据按照 GB/T 1.1— 2009 给出的规则起草。 本标准代替 SN/T 2574—2010《进出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量检测方法 气相色谱 - 质谱法》 。 本标准与 SN/T 2574— 2010 相比，主要技术变化如下：——将标准名称改为《出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱 法》 ，相应英文名称改为《Determination of amitraz and metabolites residues in royal-jelly for export— LC-MS/MS method》 。 ——将第一法 气相色谱 - 质谱法删除。 ——增加液相色谱 - 质谱 / 质谱法请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：浙江省检验检疫科学技术研究院。本标准主要起草人：侯建波、谢文、洪灯、张文华、盛涛、毛壬熠、汪鹏、颜颖鹏。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：—— SN/T 2574— 2010。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 2574—2019出口蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的测定 液相色谱-质谱 / 质谱法 1　范围 本标准规定了蜂王浆中双甲脒及其代谢产物单甲脒，2, 4- 二甲基苯基甲酰胺和 2, 4- 二甲基苯胺 残留量的液相色谱 - 质谱 / 质谱法测定方法。 本标准适用于蜂王浆中双甲脒及其代谢产物单甲脒，2, 4- 二甲基苯基甲酰胺和 2, 4- 二甲基苯胺 残留量的测定和确证。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和实验方法。 3　方法提要 试样加氨水溶液稀释后用氨水乙腈溶液沉淀蛋白并提取，通过中性氧化铝固相萃取柱对提取液 进行净化，采用液相色谱-质谱 / 质谱仪检测，双甲脒、单甲脒和 2, 4- 二甲基苯胺采用内标法定量， 2, 4- 二甲基苯基甲酰胺采用外标法定量。 4　试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1　乙腈：色谱纯。 4.2　甲酸：色谱纯。4.3　氨水：含量 25%~28%，分析纯。4.4　5% 氨水溶液：量取 95 mL 水和 5 mL 氨水（4.3） ，混匀。4.5　5% 氨水乙腈溶液：量取 95 mL 乙腈（4.1）和 5 mL 氨水（4.3） ，混匀。4.6　0.15% 甲酸溶液：量取 900 mL 水和 1.5 mL 的甲酸（4.2） ，混匀，定容至 1 000 mL。4.7　双甲脒标准品（C 19H23N3，CAS 号： 33089-61-1） ：纯度大于 99.0％。 4.8　2, 4- 二甲基苯胺标准品（C8H11N，CAS 号： 95-68-1） ：纯度大于 99.0％。 4.9　单甲脒标准品（C10H14N2，CAS 号： 33089-74-6） ：纯度大于 99.0％。 4.10　2, 4- 二甲基苯基甲酰胺标准品（C9H11NO，CAS 号： 60397-77-5 ：纯度大于 99.0％。 4.11　双甲脒 -D6同位素内标标准品（C19H17D6N3） ：纯度大于 99.0％。 4.12　2, 4- 二甲基苯胺 -D6同位素内标标准品（C8H5D6N） ：纯度大于 99.0％。 4.13　 双甲脒标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）双甲脒标准品（4.7）于 100 mL 容量瓶中， 用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 μg/mL 的标准储备液，于 0℃ ~ 4℃冰箱内储存， 有效期 4 周。以正式出版文本为准2 SN/T 2574—20194.14　2, 4- 二甲基苯胺标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）2, 4- 二甲基苯胺标准品（4.8）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 μg/mL 的标准储备液，于 0℃ ~ 4℃冰箱内储存，有效期 4 周。4.15　 单甲脒标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）单甲脒标准品（4.9）于 100 mL 容量瓶中， 用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 μg/mL 的标准储备液，于 0℃ ~ 4℃冰箱内储存， 有效期 4 周。4.16　2, 4- 二甲基苯基甲酰胺标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）2, 4- 二甲基苯基甲酰胺标 准品（4.10）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 μg/mL 的标准 储备液，于 0℃ ~ 4℃冰箱内储存，有效期 1 周。 4.17　 双甲脒 -D 6同位素内标标准储备液：准确称取 10 mg（精确到 0.1 mg）双甲脒 -D6同位素内标标 准品（4.11）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 μg/mL 的标准 储备液，于 0℃ ~ 4℃冰箱内储存。 4.18　2, 4- 二甲基苯胺 -D6同位素内标标准储备液：准确称取 10 mg （精确到 0.1 mg） 2, 4- 二甲基苯胺 -D6 同位素内标标准品（4.12）于 100 mL 容量瓶中，用乙腈（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 100 μg/mL 的标准储备液，于 0℃ ~ 4℃冰箱内储存。 4.19　 标准工作溶液：根据需要用乙腈（4.1） 将标准储备液稀释至合适浓度的标准工作溶液，现用 现配。 4.20　中性氧化铝固相萃取柱：1 g，3mL（3 mL 乙腈和 3 mL 5% 氨水乙腈溶液依次活化） ，或相当者。4.21　0.22 μm 微孔滤膜，有机相。 5　仪器和设备 5.1　液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI） 。 5.2　旋涡混合器。 5.3　离心机：转速大于 10 000 r/min。5.4　电子天平：感量为 0.01 g 和 0.1 mg。5.5　氮吹仪。5.6　具塞离心管：15 mL 和 50 mL。 6　试样制备与保存 取代表性样品约 500 g，将其用力搅拌均匀，将试样均分成两份装入洁净容器内，密封，并标明 标记。一份作为试验样，另一份在 -18 ℃以下保存。在制样过程中，应防止样品受到污染或发生所测 物残留量的变化。 7　测定步骤7.1　提取 称取约 2 g 试样（精确至 0.01 g） 于 50 mL 聚塞离心管中，加入同位素内标（200 μL，100 ng/mL） ， 加 8 mL 5% 氨水溶液（4.4） ，2 000 r/min，涡旋混合 1 min，静置 5 min，加 10 mL 5% 氨水乙腈溶液 （4.5） ，2 000 r/min，涡旋混匀 1 min，静置 5 min，加 5% 氨水乙腈溶液 （4.5） 定容至 20 mL，涡旋混匀， 8 500 r/min 离心 5 min，移取上清液 2.0 mL，加 2 mL 5% 氨水乙腈溶液（4.5） ，涡旋混匀，8 500 r/min 离心 5 min，取上清液待净化。以正式出版文本为准3 SN/T 2574—20197.2　净化 将提取溶液转移至中性氧化铝固相萃取柱（4.20） ，接收流出液，加 2 mL 5% 氨水乙腈溶液（4.5） 洗涤中性氧化铝固相萃取柱，接收全部流出液，40 ℃下氮气吹至 0.5 mL 以下，加乙腈（4.1）至 2 mL，再加 2 mL 水，涡旋混匀，过 0.22 μm 微孔滤膜（4.21） ，待 LC-MS/MS 测定。 7.3　测定 7.3.1　液相色谱参考条件7.3.1.1　液相色谱柱：C 18色谱柱，150 mm × 4.6 mm （内径） ，5 μm，或相当者。 7.3.1.2　进样量：10 μL。 7.3.1.3　柱温：25℃。 7.3.1.4　流动相：0.15% 甲酸溶液（4.6）和乙腈（4.1）梯度洗脱，见表 1。 表 1　液相色谱梯度洗脱程序 时间 /min 流速 /mL/min 0.15% 甲酸溶液 /% 乙腈 /% 0.00 0.4 60.0 40.0 8.00 0.4 35.0 65.0 9.00 0.7 5.0 95.0 14.00 0.7 5.0 95.0 15.00 0.7 60.0 40.0 16.00 0.4 60.0 40.0 19.00 0.4 60.0 40.0 7.3.2　质谱/质谱参考条件 7.3.2.1　电离方式：电喷雾电离，正离子。 7.3.2.2　扫描模式：多反应监测（MRM） 。