SN-T 2622-2019 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法

书书书犐犆犛０７．１００．９９犅１５／１９中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６２２—２０１９代替ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊犮犻狋狉犻狊狌犫狊狆．犮犻狋狉犻犌犪犫狉犻犲犾犲狋犪犾．（１９８９）２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则编写。本标准代替ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０《柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法》，与ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０相比主要变化如下： — — —对原标准柑桔溃疡病菌检疫鉴定判定程序进行了修订； — — —补充了柑桔溃疡病菌图片资料； — — —补充了柑桔溃疡病菌荧光实时ＰＣＲ检测方法等更多可选择的ＰＣＲ方法； — — —补充了柑桔溃疡病菌致病性测定反应。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国成都海关、中华人民共和国上海海关。本标准主要起草人：向勇、陈玲玲、付景圆、易建平、邵宝林、何万兴、王成华。本标准代替标准的历次发布版本为： — — —ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０。 Ⅰ犛犖／犜２６２２—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法１　范围本标准规定了进出境植物检疫中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境芸香科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）植物及其果实中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１１５７　进出境植物苗木检疫规程ＳＮ／Ｔ２１２２　进出境植物及植物产品检疫抽样３　病菌的基本信息柑桔溃疡病菌犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊犮犻狋狉犻ｓｕｂｓｐ．犮犻狋狉犻Ｇａｂｒｉｅｌ犲狋犪犾．（１９８９），属细菌域Ｂａｃｔｅｒｉａ，变形菌门Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，γ变形细菌纲Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，黄单胞菌目Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ，黄单胞杆菌科Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，黄单胞菌属犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊，该病菌的其它信息参见附录Ａ。４　方法原理该病菌的为害症状、菌落形态特性、致病性反应、ＰＣＲ特异性反应是其检疫鉴定的主要依据。５　主要试剂除另有说明，本标准中试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水参照ＧＢ／Ｔ６６８２。７０％乙醇、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、蔗糖、琼脂、溴化乙锭（ＥＢ）、琼脂糖、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ体系、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、ＴａｑＭａｎ探针等。６　仪器设备体式显微镜、超挣工作台、高压灭菌锅、生物培养箱、电子天平、普通冰箱、超低温冰箱、离心机、涡旋混匀仪、纯水仪、浊度计、ＰＣＲ仪、实时荧光ＰＣＲ仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量可调加样器、剪刀、培养皿、三角瓶。７　检疫鉴定７．１　检疫鉴定流程柑桔溃疡病菌鉴定流程如图１所示。１犛犖／犜２６２２—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.图１　柑桔溃疡病菌鉴定流程７．２　症状检查按照ＳＮ／Ｔ１１５７和ＳＮ／Ｔ２１２２中规定的程序进行现场检疫并抽取样品。实验室对样品进行症状检查，观察待检样品是否带有疑似症状（参见附录Ａ），如有症状，切取症状处组织在显微镜下观察是否有喷菌现象，如有喷菌，直接从喷菌组织分离病菌。如样品无症或有症样品未见喷菌，进行ＰＣＲ初检，ＰＣＲ方法见附录Ｂ。ＰＣＲ结果为阳性的样品再进行病菌分离。７．３　犘犆犚检测取无症样品或未见喷菌的有症样品，灭菌生理盐水室温浸泡处理３０ｍｉｎ或４℃冰箱过夜，震荡，取浸泡液１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀提取ＤＮＡ。常规ＰＣＲ或实时荧光ＰＣＲ检测（附录Ｂ），柑桔溃疡病菌ＤＮＡ作为阳性对照，非柑桔溃疡病菌ＤＮＡ作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。７．４　病菌分离有症样品症状处切取２ｍｍ×２ｍｍ小块组织，制片后于显微镜１０×～２０×倍下观察切口处是否有云雾状细菌从切口处喷出。每个样品切取５～１０个小块组织观察喷菌，分离其中有喷菌的３～５个小２犛犖／犜２６２２—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.块组织，如不足３个喷菌组织，可增加镜检的组织数量。如有喷菌，将喷菌组织块取出，无菌水冲洗一次，７０％酒精表面消毒处理３０ｓ～６０ｓ，无菌水冲洗三次，转入１００μＬ无菌水中浸泡１５ｍｉｎ；处理液于ＮＡ平板上划线分离，每个处理划线３个～５个平板；２８℃培养２ｄ～４ｄ后观察是否有典型菌落。疑似菌落纯化三次后进行下一步鉴定试验。如有症样品未观察到喷菌现象，取症状处组织剪刀剪成２ｍｍ见方小块，加入适量灭菌水中室温浸泡３０ｍｉｎ或４℃冰箱过夜，取一半处理液１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀提取ＤＮＡ，常规ＰＣＲ或实时荧光ＰＣＲ初检。阳性样品处理液稀释１０×、１００×和１０００× ，分别取１００μＬ涂布ＮＡ平板，每个处理涂布５个～１０个平板。培养和观察方法同上。如ＰＣＲ阳性样品未分离出典型菌落，可增加样本重复，或处理液不稀释直接涂布平板，观察培养情况。无症样品的初检和分离参考本方法。７．５　鉴定７．５．１　菌落形态特征ＮＡ培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整；初始为白色，后变为浅黄色；ＮＢＹ培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，粘液状；ＰＳＡ培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽。挑取可疑菌落在ＮＡ培养基平板上纯化三次后进行ｂｉｏｌｏｇ测定或ＰＣＲ鉴定。病菌生理生化特征见附录Ａ。７．５．２　犘犆犚扩增疑似分离物在ＮＡ平板上２８℃培养４８ｈ，收集菌体提取ＤＮＡ，进行常规ＰＣＲ或实时荧光ＰＣＲ检测，检测程序见附录Ｂ。７．５．３　致病性测定疑似分离物在ＮＡ上２８℃培养４８ｈ，用无菌水配成１０８ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液，采用针刺接种法接种柑桔（葡萄柚、墨西哥来檬、枸桔和甜橙）幼嫩叶片，以无菌水作为阴性对照。接种植株２８℃培养，７ｄ后开始观察叶片发病情况。对接种出现症状处组织进行病菌再分离，并与最初的接种分离物比较，完成致病性测试。８　结果评定分离获得疑似分离物，ｂｉｏｌｏｇ测定符合或ＰＣＲ检测结果为阳性，致病性测试表现典型症状，判定样品为检出柑桔溃疡病菌；其余情况判定为未检出柑桔溃疡病菌。９　样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出柑桔溃疡病菌的样品４℃保存，以备复核。样品保存期满后高压灭菌灭活处理。１０　菌株保存与处理从样品中分离并鉴定为柑桔溃疡病菌的菌株，应妥善保存。配置成１０８ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液，加入１５％～３０％甘油于－８０℃下冻存；也可将菌株冻干，－２０℃或－８０℃下长期保存。保存期满高压灭菌灭活处理。３犛犖／犜２６２２—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）柑桔溃疡病菌信息犃．１　英文名ＣｉｔｒｕｓＣａｎｋｅｒＤｉｓｅａｓｅ；Ｃｉｔｒｕｓｃａｎｋｅｒ；Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃａｎｋｅｒｏｆｃｉｔｒｕｓ；Ｃｉｔｒｕｓｂａｃｔｅｒｉａｌｃａｎｋｅｒ．犃．２　学名中文名：柑桔黄单胞柑桔亚种学名：犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊犮犻狋狉犻ｓｕｂｓｐ．犮犻狋狉犻Ｇａｂｒｉｅｌｅｔａｌ．（１９８９），简称：Ｘｃｃ。异名：犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犮犻狋狉犻Ｈａｓｓｅ，１９１５；犅犪犮狋犲狉犻狌犿犮犻狉狉犻（Ｈａｓｓｅ）Ｄｏｉｄｇｅ，１９１