以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2985 —2020 代替 SN/T 2985—2011 马流行性感冒检疫技术规范 Quarantine protocol for equine influenza 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 2985—2020I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 给出的规则起草。 本文件代替 SN/T 2985— 2011《马流行性感冒检疫技术规范》 。本文件与 SN/T 2985— 2011 相比，主要技术差异如下：——参照《陆生动物诊断试验和疫苗手册》 （2016 版）优化了试验方法；——增加了单向辐射溶血试验；——增加了 H3N8 马流感病毒核酸检测荧光 RT-PCR 方法。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国北京海关、中华人民共和国长春海关、中华人民共和国天津 海关。 本文件主要起草人：史喜菊、柏亚铎、齐玮、汪琳、高志强、孟庆峰、张利峰、张伟、王伟利、 董志珍、槐硕。 本文件所代替文件的历次版本发布情况为： —— SN/T 2985— 2011。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 2985—2020马流行性感冒检疫技术规范 1 范围 本文件规定了马流行性感冒的临床诊断和实验室诊断。 本文件适用于进出境马流感的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 1687 马流感血凝抑制试验操作规程 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。EI ：马流感（equine influenza）EIV ：马流感病毒（equine influenza virus）HA ：血凝试验（haemagglutination）HI ：血凝抑制试验（haemagglutination inhibition）MDCK ：犬肾细胞（madin-darby canine kidney）PBS ：磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline）RT-PCR ：反转录聚合酶链反应（reverse-transcription polymerase chain reaction）SRHT ：单向辐射溶血试验（single radial haemolysis test） 4　临床诊断 4.1　临床症状 马流行性感冒是由正黏病毒科 A 型流感病毒属中两个抗原性不同的 A 型流感病毒亚型 （H7N7，称为马 -1 型；H3N8，称为马 -2 型）所引起的一种急性呼吸道疾病。易感马发病时， 临床症状表现为发热，发出刺耳的干咳，鼻流黏性脓性分泌物；有一定免疫力马发病时，上述症 状可能不会全部表现出来。 4.2　病理变化4.2.1　病理解剖变化 眼观病变为结膜潮红、水肿、外翻，呈砖红色或淡黄色，常出现角膜浑浊。上呼吸道黏膜充 血、水肿和渗出，上皮细胞脱落与局灶性糜烂。头、颈部淋巴结肿大。肺脏充血、水肿，扩张不 全。肝脏一般无明显眼观病变。以正式出版文本为准2 SN/T 2985—20204.2.2 病理组织学变化 表现为急性支气管炎与细支气管炎，以管腔内有多量嗜中性粒细胞渗出为主要特征。炎症一 过性，一般只见于发病后的头 4 d，其后炎症消退，黏膜内遗留有轻度淋巴细胞，浆细胞浸润。 严重的病例为急性支气管间质性肺炎，表现为肺泡纵膈普遍增厚，增生的细胞为组织细胞与淋巴 细胞。肝脏可发现肝窦状隙内有弥散性或结节性淋巴细胞、组织细胞浸润。 4.3 流行病学 自然条件下，只有马属动物易感，没有年龄、性别和品种差别。病马咳嗽喷出含有病毒的飞 沫，经呼吸道传染是本病主要的传播方式。实验证明，此病可通过空气传播，也可通过污染的饲 料、饮水经口传染。 病毒在康复马匹的精液中存在很久，因此性交也是此病的一种重要传播方式。本病传播极为迅速，引进易感畜群，呈爆发性流行，经 1 周或稍多些时间，所有易感马都感染发病。本病一年四季均可发生，我国北方地区以春秋多发。有些地区则多发生于冬末春初，而另一些地区则流行于夏季。 5 实验室诊断 5.1 病原分离鉴定 5.1.1 实验室生物安全要求 马流感病毒病原分离鉴定应在生物安全 2 级实验室或相应级别的生物安全柜中进行，实验室 条件应符合 GB 19489 要求。 5.1.2 设备、材料和试剂 5.1.2.1 设备 高速台式冷冻离心机、台式离心机、旋涡振荡器、冰箱 （4 ℃和 -20 ℃） 、高压灭菌锅、酶标仪、 荧光 PCR 仪、PCR 反应管或反应板、倒置显微镜、微量可调移液器（10 μL、200 μL、1 000 μL ）。 5.1.2.2 材料和试剂 5.1.2.1 采样用：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5 mL 离心管、研钵，采样工具应经 121 ℃±2℃、 15 min 高压灭菌并烘干，pH 7.2、0.01 mol/L PBS，配制方法见附录 A，抗生素（青霉素和链霉素） 。 5.1.2.2 鸡胚接种用：照蛋器、打孔器、酒精灯，5% 碘酊，70% 酒精，1.0 mL 一次性灭菌注射 器，石蜡，9~11 日龄 SPF 鸡胚。5.1.2.3 尿囊液活性测定用：96 孔 V 型微量反应板，振荡器，微量加样器，阿氏液，鸡红细胞悬 液，配制方法见附录 B。5.1.2.4 细胞接种用：犬肾细胞，新生犊牛血清，细胞培养瓶，MEM 培养液，配制方法见附录 C。 5.1.2.5 病毒抗原 ELISA 检测用：ELISA 检测试剂盒。 5.1.2.6 荧光 RT-PCR 用：TriZol 或其他病毒 RNA 提取试剂盒，反转录磁珠（RT-PCR Ready-To- GoTM beads） ， Taq DNA 聚合酶，三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇（分析纯） 。 5.1.3 采样、送样和处理 5.1.3.1 在临床症状出现后立即采取样品，样品包括鼻咽拭子或鼻、气管冲洗物。 5.1.3.2 拭子是用缠在金属丝上的吸水棉或纱布做成。取样时将鼻咽拭子经前侧鼻道送入鼻咽部 并停留大约 1 min，粘取呼吸道黏液，取出后立即放入盛有运输培养液的小瓶中。鼻、气管冲洗以正式出版文本为准3 SN/T 2985—2020物通过鼻内窥镜检查采取。 5.1.3.3 运输培养液是含有 40% 甘油的 PBS，或是含有 2% 胰蛋白酶的磷酸盐肉汤﹝加 2% 抗生 素溶液（青霉素和链霉素各 10 000 IU/100 mL）和两性霉素 B（250 mg/mL 母液）﹞。5.1.3.4 如果样品在 1 d~2 d 内接种，则 4 ℃保存即可；如果要长时间保存，则应在 -70 ℃或更 低温度保存，运送样品也应冷藏运输。5.1.3.5 将液体通过挤压从鼻咽拭子挤出，1 500 g 离心 15 min，取上清液使用。剩余液体放 在 -70 ℃或更低温度保存。 5.1.4 鸡胚病毒分离 5.1.4.1 将 9~11 日龄 SPF 鸡胚放在照蛋器上照视检查，并用铅笔画出气室与胚胎位置，在气室 边缘上 2 mm~8 mm 处避开血管作一标记，并在鸡胚绒毛尿囊膜血管相对较少一侧气室作标记。 5.1.4.2 将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用 5% 碘酊消毒蛋壳气室后，用 70% 酒精脱碘消毒， 用无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔，勿损伤壳膜。5.1.4.3 用 1.0 mL 注射器吸取 0.2 mL 处理好的样品，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜注入尿囊腔。 每个样品接种 5 个鸡胚。5.1.4.4 接种后，石蜡熔化封孔，于 34 ℃~35℃孵化箱内继续孵育 3 d。接种后 24 h 内死亡的鸡 胚弃去。 5.1.4.5 将接种 24 h 后死亡和 3 d 内仍然存活的鸡胚转移到 4 ℃冰箱中 4 h 或过夜，使鸡胚死亡， 无菌收取尿囊液。 5.1.5 尿囊液血凝性测定 5.1.5.1 操作步骤 5.1.5.1.1 在微量反应板的 1~12 孔内加入 PBS，每孔 0.025 mL。 5.1.5.1.2 再吸取按 5.1.4.5 步骤收集的鸡胚尿囊液 0.025 mL（尿囊液病毒抗原处理方法见 SN/T 1687— 2005）加入第 1 孔，混匀。 5.1.5.1.3 从第 1 孔吸取 0.025 mL 液体加入第 2 孔，混匀后吸取 0.025 mL 液体加入第 3 孔，如 此倍比稀释至第 12 孔，吸弃 0.025 mL。5.1.5.1.4 每孔再加入 0.025 mL PBS。 5.1.5.1.5 每孔再加入 0.025 mL 1% 的鸡红细胞悬液，加之前，红细胞悬液要充分摇匀。 5.1.5.1.6 轻轻振荡混匀，在 20 ℃~25℃下静置 40 min 后观察结果，也可于 4 ℃下静置 60 min 后观察结果。 5.1.5.2 结果判定 当红细胞被凝集时，红细胞均匀分布在反应板底部，反应板倾斜片刻不下滑；红细胞未被凝 集时，反应板倾斜片刻，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线。出现凝集的最高稀释倍数的倒 数为 HA 滴度。判定如