以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3306.16 —2021 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11. 020 CCS C 62 2021 -06-18发布 2022 -01-01实施国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法　第16部分：寨卡病毒 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port Part16: Zika Virus以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 3306.16—2021前 言 本部分按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的 规定起草。 本文件是 SN/T 3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》的第 16 部分。SN/T 3306 已 经发布了以下部分： ——第 1 部分：鼠疫杆菌； ——第 2 部分：产毒素霍乱弧菌；——第 3 部分：志贺氏菌； ——第 4 部分：嗜肺军团菌； ——第 5 部分：布鲁氏菌；——第 6 部分：黄热病毒；——第 7 部分：猴痘病毒；——第 8 部分：基孔肯雅病毒；——第 9 部分：结核分枝杆菌；——第 10 部分：炭疽芽孢杆菌；——第 11 部分：副溶血性弧菌；——第 12 部分：空肠弯曲菌；——第 13 部分：疟原虫；——第 14 部分：大肠杆菌 O157:H7；——第 15 部分：沙门氏菌；——第 16 部分：寨卡病毒。——第 17 部分：包虫。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：烟台国际旅行卫生保健中心、天津国际旅行卫生保健中心、中国科学检验检 疫科学研究院、甘肃国际旅行卫生保健中心、北京蓝谱生物科技有限公司。 本文件主要起草人：钟响、刘宁、高娟娟、左锋、韩辉、刘鹏、王颖、方绍庆、王莉、米佳。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 3306.16—2021国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法　第16部分：寨卡病毒 1　范围 本文件规定了国境口岸寨卡病毒的环介导恒温扩增（LAMP）检测方法。 本文件适用于国境口岸出入境人员血液、尿液、唾液等及埃及伊蚊、白蚊伊蚊携带寨卡病毒的 筛查检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 租用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要素SN/T 4652.2 国境口岸寨卡病毒病防控技术规范　第 2 部分：标本采集和处理方式SN/T 4652.3 国境口岸寨卡病毒病防控技术规范　第 3 部分：实验室检测病原微生物实验室生物安全管理条例（中华人民共和国国务院令第 424 号） 3　缩略语 下列缩略语适用于本文件。RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra acetic acid）LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification） 4　生物安全措施及防污染措施 寨卡病毒在我国归属于三类病原微生物，应在生物安全二级实验室（BSL-2）开展实验室检测。 应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全防护工作。 LAMP 扩增灵敏度高使得其更容易污染导致假阳性，因此应高度重视扩增产物的污染问题，反应 过程中和反应完成后应避免开盖。加样过程应在生物安全柜进行，加样顺序为：阴性对照、样本、阳性对照，切勿打乱顺序，否则易出现假阳性。废弃物处理应符合 GB 19489 中的规定。 5　技术概要 根据寨卡病毒的 NS5 基因序列设计内、外引物及环状引物，识别靶序列上的 8 个独立区域，利用 Bst DNA 聚合酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而 复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 - 环 DNA 混合物，同时从 dNTP 析出大量焦磷酸根离子。添加的以正式出版文本为准2 SN/T 3306.16—2021钙黄绿素显色剂初始与锰离子结合处于荧光淬灭状态，随着反应的进行，焦磷酸根离子夺去结合的锰 离子，钙黄绿素恢复从而发出绿色荧光，进而与反应液中的镁离子结合使荧光增强。 6　试剂和材料6.1　引物：根据寨卡病毒特有的 NS5 基因（见附录 A）设计一套特异性引物、包括外引物 1、外引物 2、内引物 1、内引物 2 和环状引物 1、环状引物 2。 外引物 1（F3，5’-3’ ） ：GCAGAGCAATGGATGGGATA 外引物 2（B3，5’-3’ ） ：CCCATCCTTGAGGTACAGCT内引物 1（FIP，5’-3’ ） ：AAGAACCTGAGGGCATGTGCAAGACTCAAACGAATGGCGGT内引物 2（BIP，5’-3’ ） ：CACAGGAGTGGAAACCCTCGACTGAAGTGGTGGGAGCAGA环状引物 1（LF，5’-3’ ） ：CACAACGCAGTCATCTCCAC环状引物 2（LB，5’-3’ ） ：TGGAGCAATTGGGAAGAAGTCC 6.2　核算提取试剂盒：QIAamp Viral RNA Kit 1）或市售等效产品。 6.3　Bst DNA 聚合酶和 AMV 逆转录酶：均为 8 U/ μL。 6.4　 2×ThermoPol 缓冲液：含 40 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8） 、20 mmol/L （NH4）2SO4、20 mmol/L KCl、 16 mmol/L MgSO4、0.2% Tween 20、1.6 mol/L 甜菜碱、dNTPs 每种浓度 2.8 mmol/L 。 6.5　钙黄绿素。 6.6　阳性对照：可溯源的标准质粒，或含目的片段的 RNA 亦可。6.7　0.2 mL 和 1.5 mL 塑料离心管。6.8　吸头，配套移液器使用。 7　仪器和设备7.1　移液器：量程 0.1 μL ～2 μL，量程 0.5 μL ～10 μL，量程 10 μL ～100 μL，量程 100 μL ～1 000 μL。 7.2　高速台式离心机：≥ 7 000 g。 7.3　水浴锅或加热模块：65 ℃±1 ℃和 95 ℃±1 ℃。 7.4　组织研磨器。7.5　紫外线照射装置：波长 240 nm～ 260 nm，350 nm～ 370 nm。 7.6　计时器。 8　检测程序 寨卡病毒检测程序见图 1。 9　操作步骤9.1　样本的采集、保存和运输 样本采集、保存和运输按照 SN/T 4652.2 确定的执行。 1） 　给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其它等效产品具有相同 的效果，则可使用这些等效产品。以正式出版文本为准3 SN/T 3306.16—20219.2　模板RNA提取 从血液、尿液、唾液样本或蚊虫样本中提取 RNA 采用 6.2 所示病毒 RNA 提取试剂盒或采用市售等 效产品，详见试剂盒说明书。 9.3　LAMP检测 9.3.1　反应体系 寨卡病毒的环介导引物恒温扩增反应体系见表 1. 表1　寨卡病毒环介导引物恒温扩增反应体系 试剂名称 储备液浓度 体系加样 / μL 2×ThermoPol 缓冲液 — 12.5 F3 引物 5 pmol 0.1 B3 引物 5 pmol 0.1 FIP 引物 40 pmol 0.8 BIP 引物 40 pmol 0.8 LF 引物 20 pmol 0.4 LB 引物 20 pmol 0.4 Bst DNA 聚合酶 8 U/μL 1 AMV 逆转录酶 8 U/μL 1 模板 — 2 ddH2O — 5.9 总体积 25图1　寨卡病毒LAMP检测程序待测样品 模板 RNA 提取样品前处理 LAMP 反应 阴性 阳性 结果报告以正式出版文本为准4 SN/T 3306.16—20219.3.2　反应过程 按照表 1 所述配制反应体系，上述组份加入后，再加入 1 μL 的钙黄绿素显色液，轻柔上下颠倒混 匀，瞬时离心 10 s。盖上管盖后，置于 64 ℃恒温扩增 50 min，之后于 95 ℃加热 2 min 以终止反应。 9.3.3　设置空白对照、阴性对照、阳性对照 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 空白对照采用无菌水作为扩增模板。阴性对照以 RNA 提取液代替 RNA 模板。阳性对照以含靶序列的 RNA 作为扩增模板。 9.4　结果观察 取出反应管，根据管内反应液颜色变化，判断结果。如肉眼观察不明显，可使用紫外线照射装 置，在护目镜保护下观察。 9.5　结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈黄绿色的条件下： a）阳性结果：待检样品反应管液体呈黄绿色，则报告为 LAMP 检测阳性。b）阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则报告为 LAMP 检测阴性。c）寨卡病毒 LAMP 检测阳性，说明从该待测样本中检测到目的基因片段，提示可能有寨卡病毒 存在，如需确认应按照 SN/T 4652.3 确定的对该样本做进一步的分离或测序鉴定。