以正式出版文本为准I C S1 1.0 2 0 C C SC6 2 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T3 3 0 6.1 7—2 0 2 1 国境口岸环介导等温扩增 (L AMP)检测 方法 第1 7部分:包虫 L o op- m e d i a t e d i s o t h e r m a l a mpl i f i c a t i o n d e t e c t i o n m e t h o d a t f r o n t i e r po r t — — — P a r t 1 7:Hyd a t i d 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件为 S N/T 3 3 0 6—2 0 2 1《国境口岸环介导等温扩增 (LAMP)检测方法 》的第1 7部分, S N/T 3 3 0 6已发布以下部分 。 — — —第1部分:鼠疫杆菌 ; — — —第2部分:产毒素霍乱弧菌 ; — — —第3部分:志贺氏菌 ; — — —第4部分:嗜肺军团菌 ; — — —第5部分:布鲁氏菌 ; — — —第6部分:黄热病毒 ; — — —第7部分:猴痘病毒 ; — — —第8部分:基孔肯雅病毒 ; — — —第9部分:结核分枝杆菌 ; — — —第1 0部分:炭疽芽孢杆菌 ; — — —第1 1部分:副溶血性弧菌 ; — — —第1 2部分:空肠弯曲菌 ; — — —第1 3部分:疟原虫; — — —第1 4部分:大肠杆菌 O 1 5 7:H 7; — — —第1 5部分:沙门氏菌 ; — — —第1 6部分:寨卡病毒 : — — —第1 7部分:包虫。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国成都海关 、中华人民共和国福州海关 本文件主要起草人 :田绿波、刘杨、高国龙、黄恩炯、常晓松、辛文瀚、王俊贤。 ⅠS N/T3 3 0 6.1 7—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准国境口岸环介导等温扩增 (L AMP)检测 方法 第1 7部分:包虫 1 范围 本文件规定了国境口岸检测包虫病疑似样本中包虫的环介导等温扩增 (LAMP)方法。 本文件适用于国境口岸包虫的筛选检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 S N/T 1 1 9 3 基因检验实验室技术要求 WS/T 2 3 0 临床诊断中聚合酶链反应 (P C R)技术的应用 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 B s t酶:B s t DNA聚合酶(大片段) [B s t DNA po lym e r a s e (l a rge f r agm e n t) ] DNA:脱氧核糖核酸 (d e o xyr i b o n u c l e i c a c i d) d NT P:脱氧核苷三磷酸 (d e o xyr i b o n u c l e o s i d e t r iph o sph a t e) E DTA:乙二胺四乙酸 (e t hyl e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d) LAMP:环介导等温扩增 (l o op- m e d i a t e d i s o t h e r m a l a mpl i f i c a t i o n ) T r i t o n X - 1 0 0:聚乙二醇辛基苯基醚 5 技术概要 LAMP是一种连续 、恒温、基于酶反应的核酸扩增技术 。根据包虫的特异性序列基因设计特异性 内引物、外引物各一对 ,在特异性识别靶序列上的独立区域 ,利用B s t酶启动循环链置换反应 。在特异 性基因序列区启动互补链合成 ,结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 -环 DNA混合物。LAMP反应过程中 ,从d NT P析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合,产生副 产物(焦磷酸镁 )形成乳白色沉淀 ,加入显色液 ,即可通过肉眼观察判定结果 。亦可加入显色液 ,通过颜 色变化观察判定结果 。 1S N/T3 3 0 6.1 7—2 0 2 1以正式出版文本为准6 生物安全和 P C R防污染要求 实验室生物安全应符合 G B 1 9 4 8 9的规定。P C R防污染措施按 S N/T 1 1 9 3和WS/T 2 3 0的规定 执行。 7 试剂和材料 除有特殊说明外 ,所有实验用试剂均为分析纯 ;实验用水符合 G B/T 6 6 8 2中一级水的要求 。 7.1 引物:根据包虫特有线粒体 DNA CO l的靶序列基因设计一套特异性引物 ,包括外引物 1,外引物 2,内引物1,内引物2。 外引物(F 3,5’- 3’ )1:GGTTTGGGAATTATTTATTG C C T 外引物(B 3,5’- 3’ )2:C CAAATG CAGAGAAAACAT CAA 内引物(F I P,5’- 3’ )1:G GAA T C AAAAG T C AAG C A C T C AAAG T G T T AG G T G G G T T G T C T GA 内引物(B I P,5’- 3’ )2:AGTATGTGTTTAGGGGVTGGTTAGAAAAATTAC GAC GAGGACA 7.2 DNA 提取液:含2 0 mm o l/L T r i s - HC l (pH 8. 0) 、2 mm o l/L E DTA和1. 2% T r i t o n X - 1 0 0或组 织提取试剂盒 。 7.3 d NT P s :每种核苷酸浓度 1 0 mm o l/L。 7.4 B s t酶:8 U/μL。 7.5 1 0×T h e r m o P o l 缓冲 液:含2 0 0 mm o l/L T r i s - HC l (pH 8. 8) 、1 0 0 mm o l/L (NH4)2S O4、 1 0 0 mm o l/L KC l、2 0 mm o l/L MgS O4、1% T r i t o n X - 1 0 0。 7.6 MgS O4溶液:2 5 mm o l/L。 7.7 甜菜碱:5 m o l/L。 7.8 显色液:浓度为1 0 0 0× S Y B R G r e e n Ⅰ。 7.9 0. 2 mL和1. 5 mL塑料离心管 。 7.1 0 吸头,配套移液器使用 。 7.1 1 细胞保存液 7.1 2 矿物油 8 主要仪器 主要仪器设备如下 : — — —台式高速冷冻离心机 (7 0 0 0 g以上) ; — — —水浴锅或加热模块 (6 5 ℃±1 ℃和1 0 0 ℃±1 ℃) ; — — —微量可调移液器一套 (含以下3种规格:0. 5 μL~1 0 μL,1 0 μL~1 0 0 μL,1 0 0 μL~1 0 0 0 μL) ; — — —计时器; — — —-8 6 ℃冰箱。 9 检测程序 包虫检测程序见图 1。 2S N/T3 3 0 6.1 7—2 0 2 1以正式出版文本为准 图1 包虫L AMP检测程序 1 0 样品采集与运输 1 0.1 样品采集 1 0.1.1 粪便标本 采集犬新鲜粪便于一次性无菌采便管内 ,成形便采集 5 g~8 g,放入采便管内 。采便管外表贴上带 有唯一识别号码的标签 ,直接用于检测 ,或保存,或送检。 1 0.1.2 组织标本 外科手术切除包虫病人不同感染部位囊性或泡性组织标本 ,用生理盐水清洗 5次,放入无菌容器 , 加入7 0%以上酒精 ,一个宿主含多个包囊视为多个分离株 。密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标 签,或保存,或送检。 1 0.2 样本的运送与保存 样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输 。粪便应保存于 -8 0 ℃冷冻3天后检测 ,组织标本 酒精固定后常温保存 。 1 1 实验室检验 1 1.1 样品处理 取黄豆大小约 1 0 0 mg~2 0 0 mg的粪便标本 ,加入5 0 0 μL的生理盐水 ,振荡混匀 ,制成2 0%~4 0% 3S N/T3 3 0 6.1 7—2 0 2 1以正式出版文本为准的悬液;或取组织标本 2 g,加入细胞保存液 。4 ℃,8 0 0 0 g离心2 m i n。转移上清至灭菌的干净离心 管。不能立即进行检测时 ,样本冻存于 -7 0 ℃超低温冰箱备用 。 1 1.2 核酸提取 在1 1. 1获得处理后样本加入 1 0 0 μL DNA提取液充分混匀 ,沸水浴1 0