以正式出版文本为准SN/T 3559 —2021 代替 SN/T 3559— 2013 国境口岸裂谷热病毒检测方法 Detecting methods on Rift Valley fever virus at frontier ports 2021 -06-18发布 2022 -01-01 实施ICS 11. 020 CCS C 62 中华人民共和国海关总署 发 布中华人民共和国出入境检验检疫行业标准以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 3559—2021I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件代替 SN/T 3559— 2013《裂谷热病毒 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测方法》 。本文件与 SN/T 3559— 2013 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： ——增加了裂谷热病毒一步法核酸检测技术及具体流程； ——增加了裂谷热病毒环介导恒温扩增检测技术及具体流程；——术语和定义中增加了对实时荧光 RT-PCR、一步法核酸检测技术、环介导恒温扩增技术等定义； ——明确 PCR 防污染措施按 WS/T 230 的规定执行； ——增加了附录 B 阳性对照序列，对各方法所采用的阳性序列进行了说明。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国广州海关、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：戴俊、李小波、吕洁毅、郑夔、师永霞、相大鹏、洪烨、袁帅、孙芳芳、 黄树详、刘丽娟、黄吉城。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 3559—2021国境口岸裂谷热病毒检测方法 1 范围 本文件规定了国境口岸裂谷热病毒检测的生物安全要求，样本的采集、运输、保存、前处理及 多种具体检测方法。 本文件适用于国境口岸出入境人员感染或媒介蚊虫携带裂谷热病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引 用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修 改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 卫科教发〔2006〕15 号） 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 裂谷热病毒 Rift Valley fever virus 一种 RNA 病毒，属布尼亚病毒科（ Bunyaviridae ）白蛉热病毒属（ Phlebovirus ） ，含单链 RNA 基因组，由 L、M 及 S 三个亚单位组成。 裂谷热病毒目前仅有一个血清型，被笼统分为北非、西非、中东非 3 个群。 3.2　 逆转录聚合发酶 reverse transcription ploy merase chain reaction; RT-PCR 聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，由一条 RNA 单链转录为互 补 DNA（cDNA）称作“逆转录” ，由依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖 DNA 的 DNA 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的 RNA 模板被 RNA 酶降解，留下互补 DNA。 3.3　 实时荧光 RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR 实时荧光 RT-PCR 方法是在常规 RT-PCR 的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为 一段寡聚核苷酸，两端分别标记 1 个荧光报告基团和 1 个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团 发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，利用 Taq酶的 5 ’-3’外切酶活性将探针酶切降解， 使报告基团和淬灭基团分离，从而使荧光监测系统可以接收到荧光信号。以正式出版文本为准2 SN/T 3559—20213.4　 一步法核酸检测技术 one-step nucleic acid detection method 不需经过样本前处理、核酸提取、纯化等步骤，采用通用型一步法核酸（RNA）检测试剂盒 或等效产品，加入检测样本、病毒特异性引物和探针进行检测，实现将临床样本直接加到反应体 系中进行实时荧光 RT-PCR 检测的方法。 3.5　 环介导恒温扩增技术 loop-mediated isothermal amplification method; LAMP 一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异引物，在链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60 ℃~65 ℃恒温扩增，15 min~60 min 左右即可 实现 109~1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。 4　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BLAST ：是一套在蛋白质数据库或 DNA 数据库中进行相似性比较的分析工具，采用一种局 部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。 Ct 值：在实时荧光 RT-PCR 中，每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 FAM ：6- 羧基 - 荧光素，一种荧光报告基团。RNA ：核糖核酸。 5　检测对象 5.1　国境口岸疑似感染裂谷热病毒的出入境人员或疑似携带裂谷热病毒的媒介蚊虫。 5.2　其他申请检验的人员或媒介蚊虫。 6　生物安全和 PCR 防污染要求6.1　生物安全要求 按照 GB 19489 和 《人间传染的病原微生物名录》 的要求，裂谷热病毒检测相关生物安全要求如下： ——裂谷热病毒危害程度分类为第二类；——裂谷热病毒培养应在生物安全三级（BSL-3）实验室进行；——未经培养的裂谷热病毒感染性材料的操作应该在生物安全二级（BSL-2）实验室进行；——裂谷热病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室进行；——裂谷热病毒感染性材料运输和包装分为 A 类，UN 编号为 UN 2814。 6.2　PCR 防污染要求 PCR 防污染措施按照 WS/T 230 确定的规定执行。 7　主要仪器 7.1 荧光定量 PCR 仪。 7.2 PCR 扩增仪。以正式出版文本为准3 SN/T 3559—20217.3 超净工作台。 7.4 IIA 级生物安全柜。 7.5 电泳仪。 7.6 水平电泳槽。 7.7 凝胶成像系统。 7.8 千分之一天平。 7.9 高压灭菌器。 7.10 -70 ℃超低温冰箱（或液氮罐） 。 7.11 台式高速低温离心机（带密封的离心安全杯） ，最大离心力 20 000 g。 7.12 涡旋振荡器。 7.13 微量移液器。 7.14 计时器。 7.15 水浴锅、金属浴。 8　主要试剂 8.1　实时荧光 RT-PCR 法使用试剂8.1.1 核酸提取试剂：美国 Qiagen 公司 QIAamp Viral RNA Kit1）。a 8.1.2 实时荧光 RT-PCR 通用试剂：美国 Ambion 公司 Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit1）。 8.1.3 无 RNA 酶的 DEPC 水。 8.1.4 引物和探针：引物和探针序列见表 1。 表 1 裂谷热病毒实时荧光 RT-PCR 检测的引物和探针 引物 / 探针名称 序列（5 ’-3’） 扩增片段 RVF-qFP ATTCCTGAGACACATGGCAT 86 bp RVF-qRP CACTTCCTTGCATCATCTGA RVF-qPro FAM- CACAAGTCCACACAGGCCCCTTACATT–BHQ1 注： 探针的 5 ’端标记的是 FAM 荧光报告基团，3 ’端标记的是 BHQ1 荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和淬 灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 8.2　RT-PCR 法使用试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。 8.2.1 核酸提取试剂：见 8.1.1。 8.2.2 RT-PCR 试剂：美国 Qiagen 公司 One step RT-PCR kit1）； 8.2.3 无 RNA 酶的 DEPC 水。 8.2.4 电泳缓冲液（TAE） ，配方见附录 A。 8.2.5 溴化乙锭（EB，有毒有害物质，操作需谨慎） ：10 mg/mL，使用浓度为 0.5 μg/mL，配方见 附 录A； 8.2.6 引物：本方法设计两对引物序列，分别对裂谷热病毒核酸的 S 基因序列和 L 基因序列进行 1） 　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。以正式出版文本为准4 SN/T 3559—2021检测。引物序列见表 2，可选用其中一对引物进行 RT-PCR 扩增。 表 2 裂谷热病毒 RT-PCR 检测的引物序列 引物 / 探针名称 序列（5 ’-3’） 扩增片段 RVF-SPF CTGAACATCTGGGATTGGAG S 基因片段，预期扩增大小为 635 bp RVF-SPR CCCTGTTGTGTCTTTCTCAT RVF-LPF GGATCACATATCTGAATTTCTCTCT L 基因片段，预期扩增大小为 564 bp