书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜３ ７ ６ ７．１ ７—２ ０ １ ４ 出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （犔 犃犕犘）检测方法第１ ７部分：大豆犇 犘３ ５ ６ ０ ４ ３品系 犔 狅 狅狆 犿 犲 犱 犻 犪 狋 犲 犱犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉 犿 犪 犾犪 犿 狆犾 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉 犵犲 狀 犲 狋 犻 犮 犪 犾 犾 狔犿 狅 犱 犻 犳 犻 犲 犱犮 狅 犿 狆狅 狀 犲 狀 狋 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱犳 狅 狉犲 狓 狆狅 狉 狋—犘 犪 狉 狋１ ７：犛 狅狔犫 犲 犪 狀犇 犘 ３ ５ ６ ０ ４ ３ ２ ０ １ ４０ １１ ３发布 ２ ０ １ ４０ ８０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７《出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （ＬＡＭＰ）检测方法 》共分为３ ０部分： 第１部分：通用要求和定义 ； 第２部分：筛选方法 ； 第３部分：玉米Ｂ ｔ  １ １品系； 第４部分：玉米Ｂ ｔ １ ７ ６品系； 第５部分：玉米ＧＡ ２ １品系； 第６部分：玉米Ｍ Ｉ Ｒ １ ６ ２ 品系； 第７部分：玉米Ｍ Ｉ Ｒ ６ ０ ４ 品系； 第８部分：玉米ＭＯＮ ８ １ ０ 品系； 第９部分：玉米ＭＯＮ ８ ６ ３ 品系； 第１ ０部分：玉米ＭＯＮ ８ ８ ０ １ ７ 品系； 第１ １部分：玉米ＭＯＮ ８ ９ ０ ３ ４ 品系； 第１ ２部分：玉米Ｔ  ２ ５品系； 第１ ３部分：玉米３ ２ ７ ２品系； 第１ ４部分：玉米５ ９ １ ２ ２品系； 第１ ５部分：大豆Ａ ２ ７ ０ ４  １ ２ 品系； 第１ ６部分：大豆Ａ ５ ５ ４ ７  １ ２ ７ 品系； 第１ ７部分：大豆Ｄ Ｐ ３ ５ ６ ０ ４ ３ 品系； 第１ ８部分：大豆ＧＴ Ｓ ４ ０  ３  ２ 品系； 第１ ９部分：大豆ＭＯＮ ８ ９ ７ ８ ８ 品系； 第２ ０部分：水稻Ｂ ｔ  ６ ３品系； 第２ １部分：水稻Ｋ Ｆ ６品系； 第２ ２部分：水稻Ｋ Ｆ ８品系； 第２ ３部分：水稻ＫＭＤ品系； 第２ ４部分：水稻Ｌ Ｌ Ｒ Ｉ Ｃ Ｅ ６ ２ 品系； 第２ ５部分：水稻Ｍ １ ２品系； 第２ ６部分：水稻Ｔ １ Ｃ  １ ９ 品系； 第２ ７部分：水稻Ｔ ２ Ａ  １品系； 第２ ８部分：小麦Ｂ ７ ３  ６  １ 品系； 第２ ９部分：甜菜Ｈ ７  １品系； 第３ ０部分：油菜ＲＴ  ７ ３品系。 本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７的第１ ７部分。 本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。 本部分起草单位 ：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 、中华人民共和国中山出入境检验检疫 Ⅰ犛 犖／犜３ ７ ６ ７．１ ７—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局 、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、广州迪澳生物科 技有限公司 。 本部分主要起草人 ：冯家望、唐食明、曾静、李志勇、邝筱珊、王小玉、胡松楠、游淑珠、刘李登、陈敬、 常彦磊。 Ⅱ犛 犖／犜３ ７ ６ ７．１ ７—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （犔 犃犕犘）检测方法第１ ７部分：大豆犇 犘３ ５ ６ ０ ４ ３品系 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７的本部分规定了大豆及其加工产品中转基因大豆 Ｄ Ｐ ３ ５ ６ ０ ４ ３ 品系特异性的环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）筛选检测方法 。本部分适用于大豆及其制品中转基因大豆 Ｄ Ｐ ３ ５ ６ ０ ４ ３ 品系特异性的定性检测 。本方法的定性检测低限为 ０． ５％（质量分数 ） 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ２ 　转基因产品检测 　实验室技术要求 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ３ 　转基因产品检测 　核酸提取纯化方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ７ 　转基因产品检测 　抽样和制样方法 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７ ． ２ —２ ０ １ ４　出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （ＬＡＭＰ）检测方法 　第２部分：筛选方法 Ｃ Ｒ ＬＶＬ ０ ４ ／０ ７ ＶＲ　大豆品系 Ｄ Ｐ  ３ ５ ６ ０ ４ ３  ５ 品系特异性实时定量 Ｐ Ｃ Ｒ（ｓｐｅ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄｆ ｏ ｒｔ ｈ ｅｑｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆｓ ｏ ｙｂ ｅ ａ ｎｅ ｖ ｅ ｎ ｔＤ Ｐ  ３ ５ ６ ０ ４ ３  ５ｕ ｓ ｉ ｎ ｇｒ ｅ ａ ｌ ｔ ｉ ｍ ｅＰ Ｃ Ｒ ） 。 ３　防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ２ 的规定。 ４　抽样与制样 按照Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ７ 的规定执行 。 ５　核酸提取纯化 按照Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ３ 的规定执行 。 ６　犔 犃犕犘检测方法 ６．１　原理 ６．１．１　一般原理 根据转基因大豆 Ｄ Ｐ ３ ５ ６ ０ ４ ３ 品系外源基因和大豆边界序列设计特异性内引物和外引物各一对或者 １犛 犖／犜３ ７ ６ ７．１ ７—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.添加一条或一对环引物 ，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录 Ａ。引物特异性识别目标序列上的 六个独立区域 ，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸 、寡核苷酸引物在 犅 狊 狋聚合酶的作用下启动循环链 置换反应 ，在特异目标序列启动互补链合成 ，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构 的茎环ＤＮＡ混合物；从ｄ ＮＴ Ｐ析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Ｍｇ２＋结合，产生副产物 （焦磷酸 镁）形成乳白色沉淀 ，加入显色液 ，即可通过颜色变化观察判定结果 。在反应混合体系中不应存在 ＤＮＡ聚合酶的抑制剂 。在设置合适对照和在检测下限的情况下 ，定性检测结果可清楚判断样品是否为转基 因产品。 ６．１．２　显色液显色原理 Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ是一种高灵敏的 ＤＮＡ荧光染料 ，可以嵌入方式结合到双链 ＤＮＡ的小沟内 。当它 与双链ＤＮＡ结合时，荧光信号是游离状态的 ８ ０ ０～１０ ０ ０倍。在不发生扩增反应时 ，Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ染料分子的 荧光信号不发生改变 ，颜色显现为橙色 ；当发生扩增反应时 ，随着双链 ＤＮＡ的增加，Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ染料的荧光 信号也随之大幅度增强 ，其信号强度可代表双链 ＤＮＡ分子的数量 ，同时颜色由橙色变为绿色 。 ６．２　仪器和设备 ６．２．１　超纯水发生器 。 ６．２．２　水浴锅或加热模板 ：６ ３． ０℃±０． ５℃ 和８ ０． ０℃±０． ５℃ 。 ６．２．３　离心管：０． １ｍＬ、１． ５ｍＬ。 ６．２．４　移液器：量程０． ５μＬ～１ ０μＬ；量程１ ０μＬ～１ ０ ０μＬ；量程１ ０ ０μＬ～１０ ０ ０μＬ。 ６．２．５　计时器。 ６．３　试剂和材料 除另有规定外 ，所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 ６．３．１　实验用水 ：应符合Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 。 ６．３．２　ｄ ＮＴ Ｐ ｓ 溶液：每种核苷酸浓度 １ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ６．３．３　犅 狊 狋ＤＮＡ聚合酶（如：ＮＥ Ｂ公司或具有同等效果的 ＤＮＡ聚合酶） ：酶浓度８Ｕ／μＬ。 ６．３．４　１ ０Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ｌ Ｐ ｏ ｌ 缓 冲 液：含２ ０ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ  ＨＣ ｌ （ｐＨ值 为８． ８） 、１ ０ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ硫 酸 铵、 １ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ氯化钾、２ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ硫酸镁、１％Ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎＸ  １ ０ ０ 。 ６．３．５　硫酸镁溶液 ：１ ５ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ６．３．６　甜菜碱：５ｍ ｏ ｌ／Ｌ。 ６．３．７　显色液：Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ荧光染料 ，１０ ０ ０。 ６．３．８　引物：根据转基因玉米 Ｂ ｔ  １ １品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物 ，包括外引物 １，外引物２，内引物１，内引物２，环引物１和环引物 ２。 外引物扩增片段长度 ：２ ４ ４ｂｐ外引物１（Ｆ ３，５’ ３’ ） ：ＧＣ ＣＡＴＡＡＣ Ｃ Ｔ ＣＡＴ Ｃ Ｔ Ｃ ＧＣ外引物２（Ｂ ３，５’ ３’ ） ：ＴＧＧＴ Ｃ ＴＴ Ｃ ＴＧＡＧＡＣ ＴＧＴＡＴ Ｃ ＴＴ内引物１（Ｆ Ｉ Ｐ，５’ ３’ ） ：ＡＧ Ｃ Ｃ ＴＡＴＴ Ｃ ＧＡＣ Ｃ ＴＡＡＣ ＧＡＣ Ｃ ＴＡＴＡＣ ＴＡＧＡＧ Ｃ ＣＡＴ Ｃ ＧＴＡＧＧＡＧ内引物２（Ｂ Ｉ Ｐ，５’ ３’ ） ：ＡＣ ＴＡＡＧＧ Ｃ Ｃ ＧＣ Ｔ Ｃ ＴＡＧＡＧＡＴ