书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜３ ７ ６ ７．４—２ ０ １ ４ 出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （犔 犃犕犘）检测方法第４部分：玉米犅 狋１ ７ ６品系 犔 狅 狅狆 犿 犲 犱 犻 犪 狋 犲 犱犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉 犿 犪 犾犪 犿 狆犾 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉 犵犲 狀 犲 狋 犻 犮 犪 犾 犾 狔犿 狅 犱 犻 犳 犻 犲 犱犮 狅 犿 狆狅 狀 犲 狀 狋 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱犳 狅 狉犲 狓 狆狅 狉 狋—犘 犪 狉 狋４：犕 犪 犻 狕 犲 犅 狋１ ７ ６ ２ ０ １ ４０ １１ ３发布 ２ ０ １ ４０ ８０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７《出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （ＬＡＭＰ）检测方法 》共分为３ ０部分： 第１部分：通用要求和定义 ； 第２部分：筛选方法 ； 第３部分：玉米Ｂ ｔ  １ １品系； 第４部分：玉米Ｂ ｔ １ ７ ６品系； 第５部分：玉米ＧＡ ２ １品系； 第６部分：玉米Ｍ Ｉ Ｒ １ ６ ２ 品系； 第７部分：玉米Ｍ Ｉ Ｒ ６ ０ ４ 品系； 第８部分：玉米ＭＯＮ ８ １ ０ 品系； 第９部分：玉米ＭＯＮ ８ ６ ３ 品系； 第１ ０部分：玉米ＭＯＮ ８ ８ ０ １ ７ 品系； 第１ １部分：玉米ＭＯＮ ８ ９ ０ ３ ４ 品系； 第１ ２部分：玉米Ｔ  ２ ５品系； 第１ ３部分：玉米３ ２ ７ ２品系； 第１ ４部分：玉米５ ９ １ ２ ２品系； 第１ ５部分：大豆Ａ ２ ７ ０ ４  １ ２ 品系； 第１ ６部分：大豆Ａ ５ ５ ４ ７  １ ２ ７ 品系； 第１ ７部分：大豆Ｄ Ｐ３ ５ ６ ０ ４ ３ 品系； 第１ ８部分：大豆ＧＴ Ｓ ４ ０  ３  ２ 品系； 第１ ９部分：大豆ＭＯＮ ８ ９ ７ ８ ８ 品系； 第２ ０部分：水稻Ｂ ｔ  ６ ３品系； 第２ １部分：水稻Ｋ Ｆ ６品系； 第２ ２部分：水稻Ｋ Ｆ ８品系； 第２ ３部分：水稻ＫＭＤ品系； 第２ ４部分：水稻Ｌ Ｌ Ｒ Ｉ Ｃ Ｅ ６ ２ 品系； 第２ ５部分：水稻Ｍ １ ２品系； 第２ ６部分：水稻Ｔ １ Ｃ  １ ９ 品系； 第２ ７部分：水稻Ｔ ２ Ａ  １品系； 第２ ８部分：小麦Ｂ ７ ３  ６  １ 品系 第２ ９部分：甜菜Ｈ ７  １品系； 第３ ０部分：油菜ＲＴ  ７ ３品系。 本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７的第４部分。 本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。 本部分起草单位 ：中华人民共和国广东出入境检验检疫局 、中华人民共和国汕头出入境检验检疫 Ⅰ犛 犖／犜３ ７ ６ ７．４—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中国检验检疫科 学研究院 、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 、中华人民共和国天津出入境检验检疫局 、中华人民 共和国珠海出入境检验检疫局 、仲恺农业工程学院 、广州迪澳生物科技有限公司 。 本部分主要起草人 ：高东微、凌莉、刘津、蔡颖、易敏英、谢力、曾静、李晓虹、陈颖、曹际娟、郑文杰、 冯家望、高苏娟、李志勇、石磊、关丽军、张隽、陈源树、李婷。 Ⅱ犛 犖／犜３ ７ ６ ７．４—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （犔 犃犕犘）检测方法第４部分：玉米犅 狋１ ７ ６品系 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７的本部分规定了食品中转基因玉米 Ｂ ｔ １ ７ ６品系特异性的环介导等温扩增 （ＬＡＭＰ）初筛检测方法 。本部分适用于玉米及其加工产品中转基因玉米 Ｂ ｔ １ ７ ６品系特异性成分的定性检测 。本方法的定性检测低限为 ０． ５％（质量分数 ） 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ２ 　转基因产品检测 　实验室技术要求 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ３ 　转基因产品检测 　核酸提取纯化方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ５ 　转基因产品检测 　核酸定量 Ｐ Ｃ Ｒ检测方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ７ 　转基因产品检测 　抽样和制样方法 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ７ ６ ７． ２ —２ ０ １ ４　出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （ＬＡＭＰ）检测方法 　第２部分：筛选方法 ３　防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ２ 的规定。 ４　抽样与制样 按照Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ７ 的规定执行 。 ５　核酸提取纯化 按照Ｇ Ｂ／Ｔ１ ９ ４ ９ ５． ３ 的规定执行 。 ６　犔 犃犕犘检测方法 ６．１　原理 ６．１．１　一般原理 根据转基因玉米 Ｂ ｔ １ ７ ６品系外源基因和玉米边界序列设计的内 、外、环状引物各一对 ，特异性目标 １犛 犖／犜３ ７ ６ ７．４—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.序列和引物碱基序列参见附录 Ａ。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域 ，利用犅 狊 狋酶启动循环链置换反应 ，在玉米Ｂ ｔ １ ７ ６品系特异目标序列启动互补链合成 ，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 环ＤＮＡ混合物；从ｄ ＮＴ Ｐ析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Ｍｇ２＋结合，产生副产物 （焦磷酸镁 ）形成乳白色沉淀 ，加入显色液 ，即可通过颜色变化观察判定结果 。 ６．１．２　显色液显色原理 Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ是一种高灵敏的 ＤＮＡ荧光染料 ，可以嵌入方式结合到双链 ＤＮＡ的小沟内 。当它与双链ＤＮＡ结合时，荧光信号是游离状态的 ８ ０ ０～１０ ０ ０倍。在不发生扩增反应时 ，Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ染料分子的荧光信号不发生改变 ，颜色显现为橙色 ；当发生扩增反应时 ，随着双链 ＤＮＡ的增加，Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ染料的荧光信号也随之大幅度增强 ，其信号强度可代表双链 ＤＮＡ分子的数量 ，同时颜色由橙色变为绿色 。 ６．２　仪器和设备 ６．２．１　超纯水发生器 。 ６．２．２　水浴锅或加热模板 ：６ ３． ０℃±０． ５℃ 和８ ０． ０℃±０． ５℃ 。 ６．２．３　离心管：０． １ｍＬ、１． ５ｍＬ。 ６．２．４　移液器：量程０． ５μＬ～１ ０μＬ；量程１ ０μＬ～１ ０ ０μＬ：量程１ ０ ０μＬ～１０ ０ ０μＬ。 ６．２．５　计时器。 ６．３　试剂和材料 除另有规定外 ，所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 ６．３．１　实验用水 ：应符合Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 。 ６．３．２　ｄ ＮＴ Ｐ ｓ 溶液：每种核苷酸浓度 １ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ６．３．３　犅 狊 狋ＤＮＡ聚合酶（如：ＮＥ Ｂ公司或具有同等效果的 ＤＮＡ聚合酶） ：酶浓度８Ｕ／μＬ。 ６．３．４　１ ０Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ｌ Ｐ ｏ ｌ 缓冲液：含２ ０ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ  ＨＣ ｌ （ｐＨ值为８． ８） 、１ ０ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ硫酸铵、 １ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ氯化钾、２ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ硫酸镁、１％ Ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎＸ  １ ０ ０ 。 ６．３．５　硫酸镁溶液 ：１ ５ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ６．３．６　甜菜碱：５ｍ ｏ ｌ／Ｌ。 ６．３．７　显色液：Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ荧光染料 ，１０ ０ ０。 ６．３．８　引物：根据转基因玉米 Ｂ ｔ １ ７ ６品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物 ，包括外引物 １，外引物２，内引物１，内引物２，环状上游引物和环状下游引物 。外引物扩增片段长度 ：２ ５ ０ｂｐ外引物１（Ｆ ３，５’ ３’ ） ：ＣＡＴＧＡＣ ＧＴＧＧＧＴＴＴ Ｃ ＴＧＧ外引物２（Ｂ ３，５’ ３’ ） ：ＧＣ ＧＡＧＡＡＣＡＣ ＧＡＧＡＡＧＡＧ内引物１（Ｆ Ｉ Ｐ，５’ ３’ ） ：Ｃ ＣＡＡＧＧＣ ＴＴ ＣＡＡＧＧ Ｃ ＣＡＴＴＧＡＣ Ｃ ＧＡＧＡＴ Ｃ ＴＧＡＴＧＴＴ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ内引物２（Ｂ Ｉ Ｐ，５’ ３’ ） ：ＧＣ Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ ＣＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＣ Ｔ Ｃ上游环引物 （Ｆ Ｌ Ｐ，５’ ３’ ） ：ＡＴＧＧ Ｃ ＧＴＧＣＡＴ ＣＡＡＴＧＧＡ下游环引物 （Ｂ Ｌ Ｐ，５’ ３’ ） ：Ｔ Ｃ Ｃ ＴＡＴＡＡＡＧＴ Ｃ ＧＡＴＡＣ ＣＡＣ Ｇ Ｃ ６．４　实验步骤 ６．４．１　阴性对照 、阳性对照和空白对照的设置 ６．４．１．１　阴性对照 采用不含有待测基因序列的植物基因组 ＤＮＡ为模板。 ２犛 犖／犜３ ７ ６ ７．４—２ ０ １ ４ rHgCb@g