SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2602—2010 根癌土壤杆菌的检测鉴定方法 Detection and identification of Agrobacterium tumefaciens (Smith et townsend 1907) Conn 1942 行业标准信息服务平台 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2602—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局，中华人民共和国天津出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：厉艳、王英超、吴兴海、邵秀玲、甘琴华、刘鹏。 行业标准信息服务平台 I SN/T2602—2010 根癌土壤杆菌的检测鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境植物检疫中根癌土壤杆菌检测鉴定方法。 本标准适用于进出境植物及其产品上根癌土壤杆菌的检测鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3原理 根癌土壤杆菌Agrobacteriumtumefaciens（Smithettownsend1907）Conn1942，属原核生物界 菌的形态特征、生物学特性、生化特性、致病性以及PCR特异性反应等是本标准检疫鉴定的依据。 4仪器和用具 生物显微镜、体视显微镜、超净工作台、电子天平、光照恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器 培养皿（直径：7.5cm）、恒温水浴锅（30℃～95℃）、高速冷冻离心机（18000r/min以上）、BIOLOG鉴 定仪、PCR仪、电泳装置（电泳仪、水平电泳槽）凝胶成象分析仪、微量可调加样器（2μL、10uL、20μL、 100 μL.200 μL,1 000 μL)。 5主要试剂 蛋白陈、双氧水（HzO2）、甘露醇、酵母膏、硫酸镁（MgSO4·7H2O）、琼脂粉、甘油、升汞、盐酸、次氯 醇、异丙醇、琼脂糖（电泳用）、漠化乙锭、TaqDNA聚合酶、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾 (KH,PO,）、磷酸氢二钠（NazHPO4：12H,O）、磷酸二氢铵（NH,H,PO）、氯化钙（CaCl²）、氯化钠 (NaCI)、氯化钾（KCI)、10XPCR缓冲液、10X.dNTP液、蒸馏水、牛肉浸膏、盐酸二甲基对苯撑二胺、 95%乙醇等。 6检测鉴定方法 6.1病原菌的分离 6.1.1植株中病原菌的分离 对植株进行分离时应选用瘦瘤或疑似瘦瘤，尽量选用白色幼嫩瘤。先将瘦瘤或疑似瘦瘤洗净，去 1 SN/T 2602—2010 除腐烂组织，再取表层组织切成小块约4mm²，用无菌水洗3次，置于灭菌培养血内滴加0.5mL~ 1mL无菌水，压碎并静置30min后，在酵母甘露醇琼脂培养基或营养琼脂培养基上划线分离。 6.1.2介质土中病原菌的分离 对待测介质土进行分离时先取土样用无菌水配成悬浮液，待土粒沉降后，取上部的悬浮液离心浓缩 后，在酵母甘露醇琼脂培养基或营养琼脂培养基上划线分离。 6.2分离菌的纯化 将接种后的平板置于25℃～28℃培养箱中培养48h，检查菌落情况。根据附录A中菌落在培养 基上的菌落特征，挑取可疑的单个菌落，在平板上进行分离纯化，然后进行下一步鉴定。 6.3分离菌的鉴定 6.3.1革兰氏染色反应 按GB/T4789.28一2003中的2.2进行革兰氏染色实验，并观察菌体形状。 如果染色结果为革兰氏阴性菌，且菌体形状为杆状，则继续进行下一步工作。否则排除可疑菌落。 6.3.2生理生化测定 分离菌的生理生化测定，可结合实验室条件，选用以下任一方法进行： 一分离菌的生理生化测定。A.tumefaciens的主要生理生化特征参见附录B。如果分离菌的生 理生化特征测定结果与A.tumefaciens相符合，可据此判定生理生化鉴定结果为阳性。 应用BIOLOG细菌自动鉴定系统鉴定分离菌。按BIOLOG规定的操作方法进行，如果鉴定 结果为A.tumefaciens，则判定该分离菌BIOLOG鉴定结果为阳性。 6.3.3PCR法检测 从分离培养的细菌菌株中提取核酸，进行PCR检测和电泳分析。以提取的待测菌株的核酸为模板 DNA，用A.tumefaciens标准菌株的核酸做阳性对照，用非A.tumefaciens的植物细菌核酸做阴性对 照，用双蒸水代替模板DNA作为空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。如果测试菌株的 PCR产物与阳性对照一致，则判定该菌株PCR鉴定结果为阳性,PCR检测方法见附录C。 6.3.4致病性测定 将待测菌株配成10°CFU/mL的菌悬液，用无菌水作空白对照。注射接种于健康的落地生根 （Bryophyllumsp.）植物的茎秆和叶片上，接种点用灭菌的脱脂棉蘸灭菌水保湿1d～2d，于20℃～ 27℃温室中培养3周，A.tumefaciens在茎杆和叶片上产生肿瘤，同时在茎杆产生肿瘤的部位有少量气 生根；将发病的落地生根按照6.2的方法分离得到的病原菌与标准菌株的培养特征一致，则判定结果为 阳性。 7结果判定 若分离的细菌菌株，其菌落形态特征与描述相符、符合革兰氏染色阴性的结果和菌体形状为杆状、 符合生理生化指标或BIOLOG鉴定结果或PCR鉴定结果为阳性，且致病性测定结果为阳性，可以判定 检出根癌土壤杆菌。 2