ICS 65.100 G 25 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 4177—2020 蔬菜中 4-羟基百菌清残留量的快速测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of 4-hydroxychlorothalonil residues in vegetables — Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2020 - 09 - 30 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 10 - 30 实施 发 布 DB37/T 4177—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会种植业标准化分技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业环境保护和农村能源总站。 本标准主要起草人：吴成、王蕾、赵志强、于富昌。 I DB37/T 4177—2020 蔬菜中 4-羟基百菌清残留量的快速测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了蔬菜中4-羟基百菌清（参见附录A）残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于蔬菜中4-羟基百菌清残留量的快速测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 2763 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样用乙腈匀浆提取，盐析离心后，取上清液，过滤后用液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为色谱纯，水为符合GB/T 6682中规定的一级水。 4.1 试剂 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 乙腈（CH3CN，75-05-8）。 甲醇（CH3OH，67-56-1）。 甲酸（CH2O2，64-18-6）。 醋酸铵（C2H7NO2，631-61-8）。 氯化钠（NaCl，7647-14-5），分析纯，140 ℃烘烤 4 h。 4.2 溶液配制 0.1 %甲酸+5 mmol/L醋酸铵水溶液：称取0.385 g醋酸铵于500 mL烧杯中，用水充分溶解后，准确加 入1 mL甲酸，将上述溶液转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容，现用现配。 4.3 标准品 4-羟基百菌清标准品：纯度≥98 %，标准品信息参照附录A。 4.4 标准溶液配制 4.4.1 标准储备溶液 1 DB37/T 4177—2020 准确称取适量（精确至0.1 mg）4-羟基百菌清标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度， 配制成1 000 mg/L的标准储备溶液（或购买有证标准储备溶液），0 ℃～4 ℃保存，保存期为6 个月。 4.4.2 中间标准溶液 准确吸取适量的标准储备溶液（4.4.1），用甲醇稀释配制成10 mg/L的4-羟基百菌清中间标准溶液， 0 ℃～4 ℃保存，保存期为2周。 4.4.3 标准工作溶液 准确吸取适量的中间标准溶液（4.4.2），用空白样品基质溶液稀释配制成所需浓度的标准工作溶 液，现用现配。 4.5 材料 微孔滤膜：有机系，0.22 μ m。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 - 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾负离子源（ESI ）。 分析天平：感量分别为 0.000 01 g 和 0.01 g。 组织捣碎机。 旋涡混合器。 均质器：转速不低于 15 000 r/min。 离心机：转速不低于 5 000 r/min。 6 试样制备 蔬菜样品取样部位按GB 2763的规定执行。对于个体较小的样品，取样后全部处理；对于个体较大 的基本均匀样品，可在对称轴或对称面上分割或切成小块后处理；对于细长、扁平或组分含量在各部分 有差异的样品，可在不同部位切取小片或截成小段后处理；取后的样品将其切碎，充分混匀，用四分法 取样或直接放入组织捣碎机中捣碎成匀浆，放入洁净的样品盒内，密封并做好标记。将样品于-18 ℃以 下冷冻保存。 7 分析步骤 7.1 提取 称取15.0 g试样（精确至0.1 g）于100 mL 离心管中，加入30 mL乙腈，用均质器在12 000 r/min匀浆 提取2 min，加入6 g氯化钠，再振荡提取1 min，4 200 r/min离心5 min，取上清液约2 mL，用0.22 µm滤膜 过滤，待测。 7.2 测定 7.2.1 液相色谱－串联质谱参考条件 参考条件如下： a) 色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ 色谱柱，50 mm×2.0 mm(i.d.)，1.6 μ m，或相当者； 2 DB37/T 4177—2020 b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) 流动相：A 为 0.1 %甲酸+5 mmol/L 醋酸铵水溶液（4.2），B 为甲醇，梯度洗脱程序见表 1；流 速：0.35 mL/min； 柱温：40 ℃； 进样体积：10.0 μ L； 扫描方式：负离子模式； 检测方式：多反应监测（MRM），多反应监测条件参照附录 B； 加热块温度：400 ℃； 脱溶剂管(DL)温度：250 ℃； 干燥气（N2）流速：15.0 L/min，纯度≥99.999 %； 雾化气（N2）流速：3.0 L/min，纯度≥99.999 %； 电喷雾负离子源（ESI ） 接口电压：-3.5 kV； 检测器电压：1.74 kV； 碰撞气（Ar）压力：0.23 MPa。 表1 梯度洗脱程序 时间 A/% B/% 0.5 90 10 2.0 50 50 5.0 50 50 9.0 5 95 11.5 5 95 13.0 90 10 min 注：以上质谱条件是在SHIMADZU LCMS-8040质谱仪上完成的，列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商 业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。 7.2.2 定性测定 被测试样中4-羟基百菌清色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在 ±2.5 %之内。 在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准工作溶液相一致，并 且在扣除背景后的样品质谱图中，4-羟基百菌清的质谱定量和定性离子均出现，而且同一检测批次，样 品中4-羟基百菌清的定性离子和定量离子的相对丰度比与质量浓度相当的基质标准工作溶液相比，其允 许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在4-羟基百菌清。 表2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50 % ＞20 %至 50 % ＞10 %至 20 % ≤10 % 允许相对偏差 ±20 % ±25 % ±30 % ±50 % 7.2.3 定量测定 本方法采用外标法单定量离子对定量测定,定量用标准溶液采用基质标准工作溶液。在仪器最佳工 作条件下，对基质标准工作溶液进样，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液 3 DB37/T 4177—2020 中4-羟基百菌清响应值均应在仪器测定的线性范围。本方法的4-羟基百菌清标准物质多反应监测色谱图 参照附录A，质谱图参照附录C。 7.3 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 7.4 平行试验 按以上步骤对同一试样进行平行测定。 8 结果计算和表述 液相色谱-串联质谱测定结果可由计算机按外标法自动计算，也可按式(1)计算：   V m ....................................... (1) 式中： ω ——质量分数，指试样中4-羟基百菌清残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）； ρ ——从标准工作曲线上得到的试样中4-羟基百菌清的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）； V ——提取溶剂总体积，单位为毫升（mL）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 计算结果应扣除空白值，计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保 留两位有效数字，含量超过1 mg/kg时保留三位有效数字。 9 精密度 9.1 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合 附录 E 的要求。 9.2 在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合 附录 F 的要求。 10 定量限和回收率 10.1 定量限 本方法的定量限（LOQ）参照附录A。 10.2 回收率 当添加水平为LOQ、5×LOQ、10×LOQ时, 添加回收率参照附录D。 4 DB37/T 4177—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 4-羟基百菌清中英文名称、分子式、CAS 号、保留时间、定量限和标准物质多反应监测色谱图 4-羟基百菌清中英文名称、分子式、CAS号、保留时间和定量限，参照表A.1。标准物质色谱图，参 照图A.1。 表A.1 4-羟基百菌清中英文名称、分子式、CAS 号、保留时间和定量限 序 号 1 中文名称 英文名称 分子式 CAS 号 4-羟基百菌清 4-hydroxychlorothalonil C8HCl3N2O 28343-61-5 保留时间 定量限 min mg/kg 6.91 0.01 图A.1 4-羟基百菌清标准物质多反应监测色谱图 5 DB37/T 4177—2020 BB 附 录 B （资料性附录） 4-羟基百菌清监测离子对、碰撞能量和碎裂电压 4-羟基百菌清监测离子对、碰撞气能量和碎裂电压，参照表B.1。 表B.1 4-羟基百菌清监测离子对、碰撞能量和碎裂电压 序号 1 化合物名称 4-羟基百菌清 电离模式 - 母离子 245 子离子 Q1 /V CE/V Q3 /V * 175 27 25 29 210 11 25 12 相对离子 强度/% 71.8 注：“-”代表负离子模式，“*”指定量离子，“Q1”和“Q3”分别指质谱仪碰撞池前端和后端四极杆预杆偏置电 压，“CE”指碰撞池电压，“相对离子强度”指定性参考离子与定量离子强度比。 6 DB37/T 4177—2020 CC 附 录 C （资料性附录） 4-羟基百菌清标准物质多反应监测（MRM）质谱图 4-羟基百菌清标准物质多反应监测（MRM）质谱图，参照图C.1。 图C.1 4-羟基百菌清标准物质多反应监测（MRM）质谱图 7 DB37/T 4177—2020 DD 附 录