(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211040295.6 (22)申请日 2022.08.29 (71)申请人 无锡市儿童医院 地址 214023 江苏省无锡市清扬路2 99－1 号 （金城路与清扬路交界东 南隅） (72)发明人 凌菁菁　胡静　平锋锋　王燕　 钱炜　 (74)专利代理 机构 国浩律师(南京)事务所 32284 专利代理师 谭缙 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种基于川崎病 患者血清UPLC-Q-TOF/MS代 谢组学分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于川崎病患者血清 UPLC‑Q‑TOF/MS代谢组学分析方法， 方法包 括： 收 集健康血清样本和患病血清样本； 对样本进行 UPLC‑Q‑TOF/MS检测分析， 得原始代谢指纹图谱； 将图谱进行预处理， 所得二维矩阵依次进行主成 分分析和偏最小二乘判别分析， 对 得到的模型进 行验证， 无过拟合危险， 则模型构建完成。 本发明 首次使用血清代谢谱来描述KD进展期间发生变 化的代谢物， 其中鉴定了四个潜在的生物标志 物， 1‑硬脂酰甘油磷酸肌醇被认为是KD的潜在生 物标志物， 这些发现加深了对KD病理生理变化和 发病机制的认识， 同时， 也为KD的早期预防和治 疗提供了新的思路。 权利要求书2页 说明书5页 附图6页 CN 115389667 A 2022.11.25 CN 115389667 A 1.一种基于UPLC ‑Q‑TOF/MS分析川崎病患者血清代谢组学特征、 寻找潜在生物标志物 的方法， 包括： (1)样品制备： 收集健康血清样本和患病血清样本， 对血清样本进行了处理， 作为分析 样本； (2)UPLC ‑Q‑TOF/MS检测分析： 将每个分析样本采用UPLC ‑Q‑TOF/MS法进行血清代谢组 学技术分析， 得健康血清样本和患病血清样本的原 始代谢指纹图谱； (3)将健康血清样本和患病血清样本的原始代谢指纹图谱进行图谱预处理， 得到每行 为分析样本， 每列为代谢物信息的二维矩阵， 用于进一 步的统计分析； (4)将步骤(3)的二维矩阵， 采用主成分分析PCA和正交偏最小二乘判别分析OPLS ‑DA对 疾病组与正常组的代谢变化进行 可视化分析； (5)根据血清 代谢组学 特征寻找鉴定KD的生物标志 物； 所述健康血清样本包括腹股沟疝住院患 者和其他选择的发热、 过敏性紫癜和其他免疫 疾病的外科患者。 2.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中血清样本处理方法为： 将20 μL， 0.3mg/ml内参比物2 ‑氯苯基丙氨酸和150 μL甲醇乙腈混合液(2:1， v/v)依次添加到50 μL 血清样品中， 然后在4℃下在3000rpm下旋转 1分钟并离心10分钟， 获得的上清液可用于后续 分析。 3.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中UPLC色谱条件为： 上清液进 样量为5μL， 液相色谱所用色谱柱为UPLC  BEH C18色谱柱(2.1 ×100mm2,1.7μm； Waters， Milford， MA， USA)， 柱温45℃， 水为流动相A， 乙腈为流动相B构成二元梯度洗脱系统， 实现分 离的具体梯度如下表所示， 流速为0.4ml/mi n， 在分析 过程中， 所有样品保持在4℃。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中四极杆时间飞行质谱仪Q ‑ TOF的检测条件为： 采用电喷雾离子源的正离子模式ESI+和负 离子模式ESI ‑， 离子源温度为 120℃， 锥孔气流量为50L/h， 脱溶剂气温为350℃， 脱溶剂气流量为650L/h； 在正离子和负 离 子模式下毛细管电压分别为+3.2kV和 ‑3kV， 锥孔电压均为35V(ESI+)和50V(ESI ‑)； 正离子 模式下锥孔压力为20psi， 负离子模式下锥孔压力为40psi； 在19.5分钟的分析时间内， 以 0.3秒的扫描时间和0.02秒的扫描延迟， 从5 0到1000m/z的范围内收集质心数据。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中PLS ‑DA模型参数为： R2X＝ 0.347,R2Y＝0.8 82,Q2＝0.5 34。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征是： 进行UPLC ‑Q‑TOF/MS检测分析 时， 每10个分析权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115389667 A 2样本加入一个质量控制样品， 用于实时监测分析样本从进样前 处理到分析过程中的质量控 制情况， 所述质量控制样品为血清样品的小份分别混合成混合血清。 7.根据权利要求1所述的方法鉴定的KD相关的生物标志物， 包括1 ‑硬脂酰甘油磷酸肌 醇、 鞘氨醇、 PC(16:0 /16:0)和LysoPI(18 :0/0:0)。 8.根据权利要求7所述的生物标志物， 其特征在于， 与KD相关的生物标志物为1 ‑硬脂酰 甘油磷酸肌醇。 9.权利要求7中的所述的KD相关的生物标志物在制备用于诊断川崎病的试剂 或试剂盒 中的用途。 10.根据权利要求9所述的用途， 其特征在于， 所述的KD相关的生物标志物为1 ‑硬脂酰 甘油磷酸肌醇。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115389667 A 3