(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211080401.3 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 上海烟草 集团有限责任公司 地址 200082 上海市杨 浦区长阳路717号 (72)发明人 汪阳忠　李钢　王天南　戚大伟　 陈燕芳　陈敏　费婷　吴达　 (74)专利代理 机构 上海光华专利事务所(普通 合伙) 31219 专利代理师 许亦琳　余明伟 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/14(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析 的方法、 系统及使用方法 (57)摘要 本发明提供一种多类别烟气暴露生物标志 物同时分析的方法， 包括以下步骤： 在尿液加入 内标样品、 水解、 冷冻干燥、 浓缩、 复溶后离心获 得样品溶液； 将样品溶液采用构建的多中心切割 二维液相色谱 ‑串联质谱系统分析， 通过内标法 对烟气暴露生物标志物进行准确定量。 本发明同 时提供了一种多维液相色谱质 谱联用分析系统 及其使用方法， 本发明通过第一维的分离有效去 除杂质干扰， 结合捕集柱的富集作用提升目标物 检测的灵敏度和准确性， 对前处理条件、 流动相、 色谱柱和质谱参数等进行综合优化， 可实现极性 差异大且含量差异大的多类别酸碱性化合物的 同时分析， 为人体烟气暴露评价提供一种更加高 效便捷的高通 量分析方法。 权利要求书4页 说明书12页 附图7页 CN 115326994 A 2022.11.11 CN 115326994 A 1.一种多类别烟气暴露生物标志 物同时分析的方法， 包括以下步骤： A1)在尿液加入内标样品、 水解、 冷冻干燥、 浓 缩、 复溶后离心获得样品溶 液； A2)将样品溶液采用构建的多中心切割二维液相色谱 ‑串联质谱系统分析， 通过内标法 对烟气暴露生物标志 物进行准确定量。 2.根据权利要求1所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法， 其特征在于， 步 骤A1)中， 所述水解 为酶解或酸 解； 和/或， 所述复溶 溶剂为去离 子水、 甲醇或者乙腈， 优选地， 所述复溶 溶剂为去离 子水。 3.根据权利要求2所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法， 其特征在于， 所 述酶解采用的酶为β ‑葡萄糖醛酸酶和芳基硫酸酯酶中的至少一种； 和/或， 所述 酸解采用的酸 为盐酸。 4.根据权利要求1所述的一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法， 其特征在 于， 包括以下技 术特征的一项： 1)所述多类别烟气暴露生物标志物选自可替宁、 N ‑亚硝基假木贼碱、 N ‑亚硝基新烟碱、 4‑(甲基亚硝胺) ‑1‑(3‑吡啶基)‑1‑丁醇、 1‑氨基萘、 2 ‑氨基萘、 3‑氨基联苯、 4 ‑氨基联苯、 1 ‑ 羟基萘、 2 ‑羟基萘、 1 ‑羟基芘、 1 ‑羟基菲、 2 ‑羟基菲、 3 ‑羟基菲、 4 ‑羟基菲、 9 ‑羟基菲、 2 ‑羟基 芴或3‑羟基芴中的一种或多种； 2)步骤A1)中， 内标物选自d3‑可替宁(d3‑COT)、 d4‑N‑亚硝基假木贼碱(d4‑NAB)、 d4‑N‑亚 硝基新烟碱(d4‑NAT)、 4‑(甲基‑d3‑亚硝氨基) ‑1‑(3‑吡啶基)‑1‑丁醇(d3‑NNAL)、 d7‑1‑氨基 萘(d7–1‑NA)、 d7‑2‑氨基萘(d7‑2‑NA)、 d9‑3‑氨基联苯(d9‑3‑ABP)、 d9‑4‑氨基联苯(d9‑4‑ ABP)、 d9‑1‑羟基芘(d9‑1‑OHPyr)、13C6‑3‑羟基菲(13C6‑3‑OHPhe)、13C6‑3‑羟基芴(13C6‑3‑ OHFlu)、 d7‑2‑羟基萘(d7‑2‑OHNap))的一种或多种。 5.根据权利要求1所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法， 其特征在于， 所 述采用多中心切割二维液相色谱 ‑串联质谱进行多类别烟气暴露生物标志物测定， 包括以 下步骤： B1)配制标准样品： 取可替宁、 N ‑亚硝基假木贼碱、 N ‑亚硝基新烟碱、 4 ‑(甲基亚硝胺) ‑ 1‑(3‑吡啶基)‑1‑丁醇、 1‑氨基萘、 2 ‑氨基萘、 3 ‑氨基联苯、 4 ‑氨基联苯、 1 ‑羟基萘、 2 ‑羟基 萘、 1‑羟基芘、 1 ‑羟基菲、 2 ‑羟基菲、 3 ‑羟基菲、 4 ‑羟基菲、 9 ‑羟基菲、 2 ‑羟基芴和3 ‑羟基芴成 分的标样中的任一种或多种， 加入内标样品， 再加入甲醇定容， 配成标准溶液； B2)样品检 测： 分别将步骤B1)配制的标准样品和经样品前处理后待测样品采用多中心切割二维液相 色谱‑串联质谱系统分析， 通过第一 维液相色谱进 行分离除杂， 所述多类别 烟气暴露生物标 志物根据第一维分离的保留时间分成多组捕集， 再 由第二维液相色谱进行分离， 通过质谱 进行测定， 确定待测样品中多类别烟气暴露生物标志 物成分的含量。 6.根据权利要求5所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法， 其特征在于， 步 骤B2)中， 所述多中心切割二 维液相色谱 ‑串联质谱系统分析条件包括以下技术特征的一项 或几项： C1)第一维色谱柱： 离 子交换柱、 C18柱或CN柱； 优选地， 为CN柱。 C2)补偿泵流动相： 去离子水、 甲醇、 乙腈、 磷酸盐缓冲液、 乙酸盐缓冲液、 甲酸盐缓冲 液、 氨水溶液中的至少一种； 优选地， 为去离 子水。权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 115326994 A 2C3)捕集柱： C18柱、 HILIC柱、 PAH柱、 NH2柱、 PFP柱、 Amino柱、 CN柱、 Phenyl柱中的至少一 种； C4)第二维色谱柱： C18柱、 PAH柱、 PFP柱或HILIC柱； 进一步优选地， 所述第二维色谱柱 采用C18柱； 更进一 步优选地， 所述第二维C18色谱柱为T3或RP18色谱柱。 7.根据权利要求5所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法， 其特征在于， 所 述多中心切割二维液相色谱 ‑串联质谱系统分析的条件 包括以下技 术特征的一项或几项： D1)一维色谱条件为： 一维泵流动相A相： 甲酸铵 ‑水溶液， 流动B相； 甲醇或乙腈溶 液； 第一维色谱柱 柱温： 25‑45℃， 检测波长： 23 0‑400nm； 进样量： 0.5 ‑20 μL； 流速： 0‑30min流速为0.2 ‑0.4mL/mi n， 31‑65min流速为0.0 ‑0.4mL/mi n； 补偿泵的流动相:去离 子水； 补偿流速： 5 00‑900 μL/min； 梯度洗脱程序： 0 ‑3min， 3‑5％B； 10‑15min， 85‑95％B； 21 ‑30min， 3‑5％B； D2)二维色谱条件为： 二维泵流动相A： 甲酸 ‑水溶液； 流动相B： 乙腈或甲醇溶 液； 第二维色谱柱温为25 ‑45℃； 梯度洗脱： 0 ‑12min， 3‑5％B； 15‑18min， 85 ‑95％B； 18.1 ‑23min， 3‑5％B； 30‑32min， 85 ‑ 95％B； 32.1 ‑37min， 3‑5％B； 37.1 ‑52min， 35 ‑50％B； 54 ‑59min， 85 ‑95％B； 59.1 ‑65min， 3‑ 5％B。 D3)质谱条件为： 质谱： 三重四级杆串联质谱， 采用电喷雾离子源(ESI)， 多反应监测(MRM)模式； 离子源 温度： 500 ‑600℃； 离子对驻留监测时间： 20 ‑50ms； 雾化气和辅助气压力： 50 ‑60psi； 气帘气 压力： 10‑25psi； 正离子模式扫描时， 电喷雾电压： 4000 ‑5500V； 负离子模 式扫描时， 电喷雾 电压：‑4500至‑5500V。 8.一种多维液相色谱质谱联用分析系统， 其特征在于， 包括第一维液相色谱、 补偿泵 (5)、 三通接口(4)、 多通阀(7)、 捕集柱单元、 第二维液相色谱； 所述第一维液相色谱包括进 样器、 一维柱温箱、 一维泵(1)、 一维色谱柱(2)、 检测器(3)； 所述捕集柱单元包括捕集柱和 多色谱柱选择切换阀(8)； 所述第二 维液相色谱包括有二维泵(6)、 二维柱温箱、 二 维色谱柱 (15)、 质谱(16)； 所述一维泵(1)与一维色谱柱(2)相连， 所述一维色谱柱(2)的出口经管线 与所述检测器(3)相连， 所述二维色谱柱(15)的出口经管线与质谱(16)相连； 所述三通接口 (4)经管线分别与检测器(3)的出口、 补偿泵(5)、 多通阀(7)相连， 所述多通阀(7)经管线分 别与二维泵(6)、 二维色谱柱(15)的相连， 所述多色谱柱选择切换阀(8)与多通阀(7)相连 通， 所述捕集柱与多色谱柱选择切换阀(8)连通。 9.根据权利要求8所述的多维液相色谱质谱联用分析系统， 其特征在于， 所述捕集柱单 元包括第一捕集柱(9)、 第二捕集柱(10)、 第三捕集柱(11)、 第 四捕集柱(12)、 第五捕集柱 (13)、 第六捕集柱(14)及多色谱柱选择切换阀(8)， 所述第一捕集柱(9)两端经管线分别于 与所述多色谱柱选择切换阀第一入口(81)和多色谱柱选择切换阀第一出口(82)相连， 所述 第二捕集柱(10)两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第二入口(83)和多色谱柱 选择切换阀第二出口(84)相连