ICS 65.020.30 B 44 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 862—2019 水产微生态制剂 乳酸菌生产技术规程 Aquatic probiotics --- Technical regulation for production of lactic acid bacteria 2019 - 01 - 14 发布 天津市市场监督管理委员会 2019 - 02 - 15 实施 发 布 DB12/T 862—2019 前 言 本标准依据GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求起草。 本标准由天津市农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业生物技术研究中心。 本标准主要起草人：谢凤行、张峰峰、周可、赵琼、赵玉洁、孙海波、高宝山。 I DB12/T 862—2019 水产微生态制剂 乳酸菌生产技术规程 1 范围 本标准规定了乳酸菌生产中所涉及的术语和定义、生产环境和设备要求、生产技术流程、质量检测 和储运。 本标准适用于水产微生态制剂乳酸菌的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3095 环境空气质量标准 GB 3838 地表水环境质量标准 GB 20287 农用微生物菌剂 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 能利用碳水化合物产生乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，在水产养殖中可作为饲料 添加剂和水质净化剂。 注：本 标 准 中 涉 及 的 乳 酸 菌 主 要 包 括 植 物 乳 杆 菌 (lactobacillus plantarum) 、 嗜 酸 乳 杆 菌 (lactobacillus acidophilus)、戊糖乳杆菌(lactobacillus pentosus)、德氏乳杆菌(lactobacillus leichmannii)和粪肠球 菌(enterococcus faecalis)。 3.2 原菌种 the original strain 由单菌落分离纯化，并在试管上穿刺繁殖保存的菌种。 3.3 一级菌种 first class strain 原菌种在培养皿上活化，挑取单菌落接种至玻璃瓶中，并厌氧培养的菌种。 3.4 二级菌种 second class strain 玻璃瓶中的菌种接种至种子罐中，在种子罐中厌氧放大培养的菌种。 4 生产环境和设备要求 4.1 生产环境 1 DB12/T 862—2019 4.1.1 厂区空气质量应符合大气环境质量标准 GB 3095 中Ⅱ类要求。 4.1.2 发酵用水应符合地表水环境质量标准 GB 3838 中Ⅲ类水质要求，冷却水及其他用水符合该标准 中Ⅳ类水质要求。 4.1.3 生产车间配备消毒灭菌设施，菌种储藏室和无菌操作间与生产车间分开。 4.2 生产设备 生产设备需为不锈钢发酵罐，体积根据生产规模自定。 5 生产技术流程 5.1 生产流程 见附录A。 5.2 菌种质量 5.2.1 用于发酵的菌种应有菌种鉴定报告或菌株来源相关信息。 5.2.2 发酵前应先检测菌种的纯度和性能，如不纯或退化，应先进行提纯复壮。 5.2.3 菌种在上罐生产之前需检测种子罐中菌体的纯度和浓度，不能有杂菌污染，浓度达到每毫升亿 级以上，发酵菌液 pH＜4.0。 5.3 培养基 5.3.1 原菌种和一级菌种的培养基应保证菌种生长的延滞期短，生长旺盛，碳、氮源营养丰富。 5.3.2 二级菌种培养基原则上为发酵培养基或接近发酵培养基。 5.3.3 发酵培养基在保证菌体生长旺盛的前提下，尽量利用来源充足、价格低廉的原料。 5.4 灭菌 5.4.1 液体发酵，发酵罐的装液量 60%～70%，液体培养基、发酵设备、管道、补料罐等采用高压蒸汽 灭菌，灭菌条件为 115 ℃～121℃，0.1 MPa～0.15 MPa，灭菌 20 min～30 min。 5.4.2 固体物料含水率为 50%±5%，灭菌条件为 115 ℃～121 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa，灭菌 1.0 h～ 1.5 h。 5.4.3 灭菌后无菌操作取灭菌后的培养基，制片，染色，镜检，无微生物说明灭菌彻底，若有，需重 复 5.3 的工作。 5.5 接种 一级种子到二级种子接种量为3%～5%，二级种子到发酵罐接种量为5%～7%。接种时需要无菌操作， 调节进、排气阀（通入的气体为氮气或其它惰性气体），使接种口有气体排出。 5.6 发酵 5.6.1 5.6.2 5.6.3 5.6.4 乳酸菌的发酵温度控制在 25 ℃～35 ℃。 发酵过程中不通气，或通入氮气，搅拌转数 50 r/min～100 r/min。 当有效活菌数达到每毫升十亿级，并 pH 降低到 4.0 以下，结束发酵。 发酵周期为 24 h～48 h。 5.7 发酵后处理 2 DB12/T 862—2019 发酵后的液体菌剂、固体菌剂密封包装，包装容器经过灭菌处理。 6 质量检测 6.1 检测指标 每个批次的产品抽样检测包括感官、水分、pH、有效活菌数和杂菌率等指标，检验合格方可出厂。 6.2 感官检测 6.2.1 取菌液 250 mL（或固体菌剂 250 g）于无色玻璃杯中，采用目测、鼻嗅的方法进行检验。 6.2.2 菌液为浅棕至深棕色的悬浊液，有特殊的酸香味。固体菌剂因培养基原料不同呈现不同颜色， 有特殊的酸香味。 6.3 pH 测定 按GB 20287执行。 6.4 有效活菌数检测 乳酸菌有效活菌数的测定按GB 20287规定检测。 6.5 杂菌率的测定（好氧或兼性厌氧杂菌） -5 -6 -7 从用来测定有效活菌数且已经过10倍系列稀释的样品中，选取3个稀释度（10 、10 、10 ）进行 杂菌率测定。平板计数法，按GB 20287操作。 6.6 固体菌剂水分含量测定 按GB 20287执行。 7 储运 7.1 应贮存在通风、干燥、清洁的仓库，仓库内无有害气体、易燃易爆物品及腐蚀性化学物品，远离 热源。 7.2 长途运输时，防止日晒、雨淋，避免长期受压和机械损伤，产品不应和易燃、易爆、易腐蚀的物 品同车（或其他运输工具）装运。 3 DB12/T 862—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 乳酸菌生产技术流程图 原菌种 配置培养基 纯度和性能检查 灭菌 一级菌种 接种 二级菌种 发酵 发酵物检测 不合格 合格 按规定处理 发酵后处理 质量检测 不合格 合格 按规定处理 出厂 图A.1 乳酸菌生产技术流程图 ________________________________ 4