(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211173007.4 (22)申请日 2022.09.26 (71)申请人 北京合众恒星检测科技有限公司 地址 100176 北京市大兴区北京市北京经 济技术开发区宏达南路5号 (72)发明人 常巧英　白若镔　盖丽娟　 (74)专利代理 机构 南京智造力知识产权代理有 限公司 32382 专利代理师 李侨飞 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/14(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种中药材中禁用农药、 真菌毒素及功效成 分的同时检测方法 (57)摘要 本发明属于中药材分析检测技术领域， 涉及 一种中药材中禁用农药、 真菌毒素及功效成分的 同时检测方法。 本发明通过HLB固相萃取柱进行 样品制备， 结合LC ‑Q‑TOF/MS和GC ‑Q‑TOF/MS两种 高分辨质谱 联用， 一次进样实现农药残留和真菌 毒素等外源性污染物的有效分离， 提高了仪器使 用效率， 缩短了数据采集及分析时间； 同时通过 对比净化技术， 优化冰浴和振荡顺序、 提取液酸 度、 定容液等前处理条件， 提高了样品前处理的 兼容性， 实现了中药材中禁用的33种农药(54个 单体)， 11种真菌毒素及功效成分的同时检测， 使 跨类别外源性污染物和功效成分的同时检测成 为可能， 有效的降低了实验成本， 缩短检测时间， 具有较强的实际应用价 值。 权利要求书3页 说明书23页 附图3页 CN 115452997 A 2022.12.09 CN 115452997 A 1.一种中药材中禁用农药、 真菌毒素及功效成分的同时检测方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 步骤一： 样品制备； (1)称取中药材粉末加入甲酸水溶液混合， 涡旋使药材粉末充分浸润， 放置一段时间后 再加入乙腈， 涡旋混匀， 再经振荡处理后， 加入无水硫酸镁和无水乙酸钠混合粉末， 摇散混 匀， 于冰水浴中进行冷却 一段时间， 冷却后进行第二次振荡处理， 处理后进行离心， 得到上 清液记为样品液A， 取V  mL样品液A用平行浓 缩仪或旋转蒸发仪浓 缩至V/5， 得到浓 缩液； 所述药材粉末、 甲酸水溶液、 乙腈、 无水硫酸镁和无水乙酸钠混合粉末的用量关系为 3g： 15mL： 30mL： 7.5g； 所述甲酸水溶液的体积浓度为5％～10％； 所述无水硫酸镁和无水乙 酸钠混合粉末中无 水硫酸镁与无 水乙酸钠的质量比为 4:1； (2)PRiME  HLB柱使用前无需活化， 将步骤(1)制备的浓缩液移至柱中， 下接离心管， 直 至有空气通过， 待所有液体 收集完毕之后， 再用甲醇洗脱数次， 合并数次的洗脱液， 取下离 心管在氮吹仪上吹干； 加入甲醇复溶， 然后取出1/2液体分装入另一个小试管中， 两个小试 管均用氮气吹干， 分别记 为试管Ⅰ和试管Ⅱ； 往试管Ⅰ中加入定容液 Ⅰ， 定容液Ⅰ中含有200ng/ mL莠去津D 5， 超声复溶后摇 晃， 经有机膜过滤， 得到的溶液记 为样品液B， 置于进样小瓶中用 LC‑Q‑TOF/MS测定； 在试管Ⅱ中加入定容液 Ⅱ， 定容液Ⅱ中含200ng/mL环氧七氯的乙酸乙酯； 超声复溶后 摇晃， 经有机膜过 滤， 得到的溶 液记为样品液C， 置 于进样小瓶中供GC ‑Q‑TOF/MS测定； 步骤二、 农药和真菌毒素检测条件； 步骤一的(2)中制备的样品液B通过LC ‑Q‑TOF/MS进行检测； 样品液C通过GC ‑Q‑TOF/MS 进行检测； 仪器 检测条件如下： LC‑Q‑TOF/MS检测条件： 色谱柱： SB ‑C18： 100mm ×2.1mm×3.5 μm， 柱温： 40℃； 流动相： A相为体积浓度为0.1％的 甲酸水溶液， 甲酸水溶液中还溶解有 乙酸铵， 其浓度为5mmol/L， B相为乙腈； 流速:0.4mL/ min； 梯度洗脱程序： 0～3min， 1～30％B； 3～6min， 30％～40％B； 6～9min， 40％B； 9～15min， 40％～60％B； 15～19min， 60％～90％B； 19～23min， 90％B； 23～23.01min， 90％～1％B； 23.01～27.01min， 1％B； 进样体积： 5 μL； Dual AJS ESI源； 扫描方式： 正离子全扫描； 全扫描范围： m/z  50～1000； 毛细管电压： 4000V； 雾化气体： 氮气； 雾化气压力： 0.14Mpa； 鞘气温度： 3 75℃； 鞘气流速： 11.0L/min； 干燥 气流速： 12.0L/mi n； 干燥气温度： 325℃； 碎裂电压： 145V； All Ions MS/MS模式条件： 0mi n时， 碰撞能为0V； 0.5mi n时， 碰撞能分别为0、 15和3 5V； GC‑Q‑TOF/MS检测条件： 色谱柱： HP ‑5MS UI： 30m×0.25mm×0.25 μm， 柱温： 40℃保持1min， 以30℃/min程序升温 至130℃， 再以5℃/min升温至2 50℃， 再以10℃/min升温至300℃， 保持7min； 载气： 氦气纯度 ≥99.999％， 流速： 1.2mL/min； 进样口温度： 270℃； 进样量： 1.0 μL； 进样方式： 不分流进样， 1min打开吹扫阀； 离子化模式： 电子轰击； 离子源电压： 70eV； 离子源温度： 280℃； 四极杆温度： 180℃； 溶 剂延迟： 4mi n； 离子监测模式： 全扫描； 扫描范围： m/ z 45‑550； 扫描速率： 5 Hz；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115452997 A 2步骤三、 功效成分检测； 取步骤一制 备的样品液A上机检测； 功效成分仪器条件同步骤二中LC ‑Q‑TOF/MS， 具体 如下： 色谱柱： SB ‑C18： 100mm ×2.1mm×3.5 μm， 柱温： 40℃； 流动相： A相为体积浓度为0.1％的 甲酸水溶液， 甲酸水溶液中还溶解有 乙酸铵， 其浓度为5mmol/L， B相为乙腈； 流速:0.4mL/ min； 梯度洗脱程序： 0～3min， 1～30％B； 3～6min， 30％～40％B； 6～9min， 40％B； 9～15min， 40％～60％B； 15～19min， 60％～90％B； 19～23min， 90％B； 23～23.01min， 90％～1％B； 23.01～27.01min， 1％B； 进样体积： 5 μL； Dual AJS ESI源； 扫描方式： 正离子全扫描； 全扫描范围： m/z  50～1000； 毛细管电压： 4000V； 雾化气体： 氮气； 雾化气压力： 0.14Mpa； 鞘气温度： 3 75℃； 鞘气流速： 11.0L/min； 干燥 气流速： 12.0L/mi n； 干燥气温度： 325℃； 碎裂电压： 145V； All Ions MS/MS模式条件： 0mi n时， 碰撞能为0V； 0.5mi n时， 碰撞能分别为0、 15和3 5V； 步骤四、 结果计算； (1)农药、 真菌毒素检测： (a)标准工作曲线配置： 选取空白中药材， 按照步骤一进行样品前处理， 基于化合物定 量限存在差异， 在前处理后的样品液B和样品液C中加入不同浓度的混合标准工作液， 建立 一系列浓度的基质匹配标准曲线； 其中混合标准工作液的配制为： 用甲醇与水以3:2体积比 配制成的混合标准溶 液； (b)定量计算 采用内标法定量： 根据 试样中相应化合物定量离子对峰面积， 采用步骤(a)中的线性回 归方程， 使用Mas sHunter定量分析 软件计算得到相应化 合物的浓度； (2)功效成分检测： (a)标准工作曲线配置： 吸取步骤一中的样品液A加入功效成分标准溶液， 用乙腈稀释 至一系列梯度的标准溶液， 进入质谱检测器； 以标准品的浓度(X)为横坐标， 峰面积(Y)为纵 坐标， 绘制标准曲线， 得线性回归方程； (b)定量计算： 通过试样中相应的峰面积， 采用步骤(a)中的线性回归方程， 计算得到相 应化合物的功效成分浓度。 2.根据权利要求1所述的一种中药材中禁用农药、 真菌毒素及功效成分的同时检测方 法， 其特征在于， 步骤一的(1)中所述中药 材优选为当归。 3.根据权利要求1所述的一种中药材中禁用农药、 真菌毒素及功效成分的同时检测方 法， 其特征在于， 步骤一的(1)中所述农药为65种， 具体为甲胺磷、 甲基对硫磷、 对硫磷、 久效 磷、 磷胺、 α ‑六六六、 β ‑六六六、 林丹、 δ ‑六六六、 p,p' ‑滴滴涕、 o,p' ‑滴滴涕、 p,p' ‑滴滴伊、 p,p'‑滴滴滴、 杀虫脒、 除草醚、 艾氏剂、 狄氏剂、 苯线磷、 苯线磷砜、 苯线磷亚砜、 地虫硫磷、 硫线磷、 蝇毒磷、 治 螟磷、 特丁硫磷、 特丁硫磷砜、 特丁硫磷亚砜、 氯磺隆、 胺苯磺隆、 甲磺隆、 甲拌磷、 甲拌磷砜、 甲拌磷亚砜、 甲基异柳磷、 内吸磷、 克百威、 三羟基克百威、 涕灭威、 涕 灭 砜威、 涕灭威亚砜、 灭线磷、 氯唑磷、 水胺硫磷、 硫丹硫酸酯、 α ‑硫丹、 β‑硫丹、 氟虫腈、 氟甲 腈、 氟虫腈砜、 氟虫腈 亚砜、 2,4' ‑三氯杀螨醇、 三氯杀螨醇、 硫环磷、 甲基硫环磷； 所述真菌