(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211143010.1 (22)申请日 2022.09.21 (71)申请人 广东产品质量 监督检验研究院 （国 家质量技术监督局广州电气安全检 验所、 广东省试验认证 研究院、 华 安 实验室） 地址 510670 广东省广州市黄埔区科 学城 大道10号 (72)发明人 綦艳　李锦清　李聪　黄翠莉　 张娟　 (74)专利代理 机构 广州海心联合专利代理事务 所(普通合伙) 44295 专利代理师 王洪娟 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01) G01N 30/08(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种乳粉中五氯苯酚含量的 检测方法， 包括以下步骤： 以乳粉为研究对象， 采 用碱性水溶液和乙腈为萃取剂， 在水浴加热超声 条件下提取， 提取液经调节pH值后， 用填料未封 尾的C18固相萃取柱富集和净化， 洗脱液经氮气 吹干， 酸化的甲醇 ‑水溶液复溶后， 用LC/MS ‑IT‑ TOF检测。 本方法操作简单、 回收率高、 抗基质干 扰能力强、 飞行时间质谱高分辨率定性鉴别准确 可靠， 适合各种乳粉基质中痕量五 氯苯酚的准确 定性鉴别和定量测定 。 权利要求书2页 说明书11页 附图4页 CN 115508470 A 2022.12.23 CN 115508470 A 1.一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特 征是包括以下步骤： (1)制备样品提取液： 取乳粉样品， 加入碱性水溶液， 涡旋溶解， 水浴加热超声提取， 加 入乙腈， 涡旋， 离心， 取上层液体， 再用乙腈重复提取下层样品， 合并两次提取的上层液体， 向液体中加入酸调节pH值至酸 性， 涡旋， 静置， 加水稀释得样品提取 液； (2)样品提取液的净化： C18固相萃取柱依次用甲醇、 水活化， 将步骤(1)中的样品提取液 转移至C18固相萃取柱中净化， 弃去全部流出液， 用水淋洗C18固相萃取柱， 负压抽干， 用洗脱 溶剂洗脱C18固相萃取柱中的五氯苯酚， 收集洗脱液， 经浓 缩、 复溶后， 得待测液； (3)标准溶液制备： 用甲醇稀释配制五氯苯酚标准品中间液， 用空白乳粉样品基质提取 液配制一组标准溶 液， 用于制作 与样品基质匹配的标准工作曲线； (4)含量测定： 将步骤(3)中的一组标准溶液用液相色谱 ‑离子阱‑飞行时间质谱法(LC/ MS‑IT‑TOF)测定， 制作与样品基质匹配的标准工作曲线； 选取步骤(2)中的待测液， 用LC/ MS‑IT‑TOF测定， 以五氯苯酚的四个加合物母离子同位素峰的精确质量数和保留时间定性 判断， 以五氯苯酚四个加合物母离子中响应最高的同位素峰峰面积与标准工作曲线进 行定 量， 获得乳粉中五氯苯酚的含量； (5)分子式预测： 利用液相色谱 ‑离子阱‑飞行时间质谱仪自带的Formula  Predictor分 子式预测软件结合步骤(4)获得的加合物母离子同位素峰的精确质量数推测分子式， 对阳 性样品作进一 步确证。 2.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(1)中所述 碱性水溶液是浓度为30～100mmol/L碳酸钠溶液、 浓度为50～200mmol/L碳酸氢钠溶液、 浓 度为30～100mmol/L碳酸钾溶液、 浓度为20～50mmol/L氢氧化钠溶液或氨水溶液， 其中氨水 溶液是指由含氨量为25％～27％的氨水与水按比例混合配制， 两者体积比为1： 9～4： 1； 步 骤(1)中所述乳粉样 品与所述碱性水溶液的用量关系 为1～2g： 4～8mL； 所述碱性水溶液与 所述乙腈的体积比为1： 1～1.2。 3.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(1)中水浴 加热超声提取时， 水浴温度为45～55℃， 超声波的功率为35～45khz， 超声提取时间为20～ 35min； 涡旋时采用自动涡旋混合器以2000～2500r/min剧烈涡旋提取3～5min； 离心为低温 离心， 离心时温度为 4～8℃， 转速为90 00～10000r/min， 离心时间为3～5mi n。 4.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(1)中向液 体中加入酸调节pH值至酸性时， 采用的酸为分析纯级的磷酸、 盐酸、 硫酸、 冰乙酸或甲酸； 调 节pH值至1.5～4； 静置 时间为5～10min； 加水稀释使液体总体积为50～60mL， 得提取液， 提 取液中乙腈的体积比例不超过 液体总体积25％。 5.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(2)中所述 C18固相萃取柱是指柱填料C18表面的硅羟基未经过封尾处理的C18固相萃取柱， 填料质量为 0.5～2g， 固相萃取柱体积为5～12mL； C18固相萃取柱 活化时甲醇和水的用量分别为柱体积 的1～1.5倍和1～2倍； 提取液过柱净化的流出速度控制在0.5～1mL/min之间； 待样品提取 液全部过柱后， 以柱体积的1.5～ 2倍水淋洗 C18固相萃取柱， 负压抽干 5～10min。 6.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(2)中所述 洗脱溶剂为甲醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 乙酸乙酯 ‑二氯甲烷混合溶液或 乙酸乙酯 ‑甲 醇混合溶液； 所述乙酸乙酯 ‑二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯 ‑甲醇混合溶液中所述乙酸乙酯权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115508470 A 2占乙酸乙酯 ‑二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯 ‑甲醇混合溶液总体积的50～75％； 洗脱 溶剂体 积用量为8～10mL， 洗脱 溶剂在35～ 40℃水浴条件 下保温， 分四次洗脱固相萃取柱中五 氯苯 酚； 收集洗脱液并在50～55℃水浴条件下氮气吹干， 用1～2mL体积百分含量为50～70％的 含酸甲醇水溶液复溶， 其中酸为甲酸， 甲酸的体积百分含量为0.1％， 过有机系滤膜， 制得待 测液。 7.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(3)中用甲 醇稀释配制标准中间溶液， 用不含五氯苯酚的空白乳粉样品基质提取液稀释 配制一组浓度 范围为5～10 00ng/mL的标准溶 液， 用于制作 与样品基质匹配的标准工作曲线。 8.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(4)中用液 相色谱‑离子阱‑飞行时间质谱法测定时， 其液相色谱条件包括： 色谱柱： KinetexC18， 规格 100×2.1mm， 1.7 μm； 流速： 0.15～0.20mL/min； 柱温： 30～40℃； 进样量： 20～50 μL； 流动相A 为： 甲醇‑乙腈混合溶液， 甲醇和乙腈的体积比8： 2； 流动相B为： 一级水或含体积百分含量为 0.05～0.1％甲酸的水溶液； 梯度洗脱 程序为： 0.00min： A相， 45％， B相， 55％； 2.00min： A相， 45％， B相， 55％； 3.00min： A相， 9 0％， B相， 10％； 11.00min： A相， 9 0％， B相， 10％； 11.10min： A 相， 45％， B相， 5 5％； 12.0 0min： A相， 45％， B相， 5 5％； 均为体积百分含量。 9.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(4)中用液 相色谱‑离子阱‑飞行时间质谱法测 定时， 质谱条件包括： 离子源： ESI， 负离子模式检测； 采 用自动扫描采集， 加热模块温度： 180～200℃； CDL温度： 180～200℃； 雾化器流速： 1.2～ 1.5L/min； 干燥气压力： 110～130kPa； 离子源电压： 4.5kV； 检测器电压： 1.7～1.8kV； 校准方 法： 自动调谐优化电压； 三氟 乙酸钠校准质量数； MS1采集范围为m/z  250～300， 重复扫描2 ～3次， 离子累积时间： 30～40msec； CID能量:15～25％； 以五氯苯酚的一级质谱MS1加合物 同位素离子的精确质量数和保留时间定性判断， 其中精确质量数为精确至小数点后四位； 五氯苯酚四个加合物同位素离子一级离子MS1的精确质量数范围分别为： 262.8316～ 262.8398、 264.8316～264.8398、 266.8316～266.8398、 268.8316～268.8398； 以264.8316 ～264.8398的离子峰的峰面积进行定量， 其它离子峰及其精确质量数和保留时间作为定性 判断依据。 10.根据权利要求9所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法， 其特征是： 步骤(5)分子 式 预测具体包括： 根据五氯苯酚分子式C6HCl5O， 设定化合物组成元素为C、 H、 Cl、 O， 原子个数范 围设为C:0～10； H:0～10； Cl:0～6； O:0～2； 丢失电荷设为H ‑； 应用氮规则筛查， 筛查误差为 5～20ppm； 五氯苯酚四个加合物同位素离子同时存在前提下， 设置电荷数量为1， 选择质量 数为262.8 316～262.8398的加合物离子进行分子式预测， 若结果仅有一个 分子式且与