(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211265775.2 (22)申请日 2022.10.17 (71)申请人 厦门海关技 术中心 地址 361000 福建省厦门市海沧区建港路 2165号 (72)发明人 王鹭骁　王东　陈富泓　方恩华　 徐敦明　吴媛　 (74)专利代理 机构 厦门市精诚新创知识产权代 理有限公司 3 5218 专利代理师 汪万龙 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种利用UPLC-HRMS 对食品中兽药可疑物的 筛查和非靶向分析方法 (57)摘要 本发明涉及一种利用UPLC ‑HRMS对食品中兽 药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 用于回顾性 分析可疑的和未知的外源物质， 并评估其在猪肉 样品中添加的48种 “未知”兽药初步鉴定中的性 能。 在分析过程中， 采用新开发的背景消除数据 依赖采集(BE ‑DDA)技术触发 “未知”的产物离子 (MS/MS)光谱采集， 并采用内部精确彻底的背景 消除法(PATBS)技术检测这些 “未知物”， 发现该 方法可以快速筛选出可疑物， 可用于生物样本中 未知物的回顾 性筛查和非靶向分析， 例如食品中 的兽药和农药等， 具有较好的应用前 景。 权利要求书2页 说明书11页 附图8页 CN 115469036 A 2022.12.13 CN 115469036 A 1.一种利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 其特征在于： 包 括以下步骤： (1)将兽药混合标准溶液加入新鲜猪肉匀浆， 制备试验猪肉样品； 另取新鲜猪肉作为对 照猪肉样品， 进行同样的匀浆， 只是不添加兽药混合标准溶 液； (2)分别称取所述试验猪肉样品和所述对照猪肉样品， 进行预处理和纯化， 分别得到检 测样品和对照样品， 具体包括： 2a预处理： 将所述试验猪肉样品或所述对照猪肉样品放入离心管中， 加入生理盐水和 乙腈， 得到的混合物进 行兽药提取： 用旋涡混合器将所述混合物充分混合， 超声提取后进 行 离心， 取上清液， 即为A； 吸取部分A转移至另一个离心管中， 用同样的方法再次提取兽药残 留， 再取上清液， 即为B； 2b纯化： 将A与B两份上清液标本混合后 使用HyperSep  Retain‑PEP SPE柱进一步纯化， 在相同的流速下进行样品富集， 用乙腈洗脱完成富集过程后， 将滤液收集起来， 用氮气干 燥， 然后将干燥后的残渣重新溶解后进行离心， 收集上清液用于UPLC ‑HRMS分析； (3)进行UPLC ‑HRMS分析 利用超高效液相色谱串联高分辨率质谱， 分别对所述检测样品和所述对照样品进行分 析， 分析过程中采用BE ‑DDA智能数据采集方式获取高分辨率全扫描MS和MS/MS数据， 包括： 分析物的全扫描质谱数据集使用AcquireX获得， 产品离子光谱数据集使用阶进 更高能量碰 撞诱导解离碰撞能量； 采用背景消除数据依赖采集BE ‑DDA方法获得检测猪肉样品的产品离子光谱和片段数 据集， 在BE ‑DDA的数据采集中， 连续N次UPLC ‑HRMS注射， 其中N为≥3的正整数， 第一次和第 二次注射作为准备步骤， 在没有获取任何产品离子或片段光谱数据的情况下， 记录控制和 测试猪肉样品的全扫描质谱数据集， 将这些数据集用来自动构建排除列表和包含列表； 接 下来的第三次注 射进行MS/MS采集步骤， 在每次注入后， 包含和排除列表会自动更新； 在MS / MS采集步骤过程中， 根据纳入和排除名单中获得的信息， 自动记录检测猪肉样品中感兴趣 的分析物的产品离 子光谱数据， 并进行筛查和分析， 以获得兽药 可疑物信息 。 2.根据权利 要求1所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 其特征在于： 步骤(2)中分别准确称取1.0g的所述试验猪肉样品和所述对照猪肉样品， 进 行 预处理和纯化， 分别得到检测样品和对照样品， 具体包括： 2a预处理： 将所述试验猪肉样品或所述对照猪肉样品放入10mL聚丙烯离心管中， 加入 2mL生理盐水和4ml乙腈， 得到的混合物进行兽药提取： 用旋涡混合器将所述混合物充分混 合30s， 超声提取15min， 然后在室温下5000rpm离心10min， 取上清液， 即为A； 吸取部分A转移 至另一个10mL离心管中， 用同样的方法再次提取兽药残留， 再 取上清液， 即为B； 2b纯化： 将A与B两份上清液标本混合后 使用HyperSep  Retain‑PEP SPE柱进一步纯化， 在开始纯化上清液之前， 先通过3mL蒸馏水和1mL/min流速的甲醇活化SPE柱； 然后， 在相同 的流速下进行样品富集， 用3ml乙腈洗脱完成富集过程后， 将滤液收集起来， 用37℃的氮气 干燥， 然后将干燥后的残渣溶于100μL体积浓度为67％的甲醇的水溶液中， 涡旋混合溶解 后， 12000rpm离心5mi n， 收集上清液用于UPLC ‑HRMS分析。 3.根据权利 要求1所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 其特征在于： 步骤(3)中超高效液相色谱的色谱柱为Hypersil  Gold C18色谱柱， 尺寸为权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115469036 A 22.1mm*100mm*1.9 μm， 流动相由甲酸水溶液和乙腈混合组成， 所述甲酸水溶液作为A相， 甲酸 体积浓度为0.1％， 乙腈作为B相； 所述流动相的流速为0.3mL/min， 进样量为3 μL； 采用以下 梯度洗脱:初始洗脱5％(B)， 保持2分钟， 然后5 ‑50％(B)2 ‑20min,50 ‑95％(B)20 ‑29min, 95％(B)29‑30min,95 ‑5％(B)30 ‑30.5min,5 ％(B)30.5 ‑35min， ％表示体积浓度， 保持40℃ 柱温。 4.根据权利 要求1所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 其特征在于： 步骤(3)中高分辨率质谱的+ESI运行参数为:喷雾电压3.5kV； 离子转移管温 度， 275℃； 蒸发器温度， 350℃； 护套气流速， N2， 40个任意单位； 辅助气体的流速， N2， 10个任 意单位； 扫描气体流速， N2， 任意1个单位； 扫描范围设置为m/ z 100到1200。 5.根据权利 要求1所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 其特征在于： 步骤(3)中分析物的全扫描质谱数据集使用AcquireX获得， 分辨率为60,000， 半峰全宽， m/z为200； 产品离子光谱数据集使用阶进更高能量碰撞诱导解离碰撞能量， ％: 10,30和50， 半峰全宽m/ z为200时， 分辨 率为15,000。 6.根据权利 要求1所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 其特征在于： 步骤(3)中对记录控制和 测试猪肉样品的全扫描质谱数据集进行PATBS处 理。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向 分析方法， 其特 征在于： 所述食品为猪肉。 8.根据权利要求1 ‑6任一项所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向 分析方法， 其特征在于： 所述兽药混合标准溶液为M种 不同兽药混合的水溶液， M为40 ‑50的 正整数。 9.根据权利 要求8所述利用UPLC ‑HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法， 其特征在于： M为48， 所述兽药混合标准溶液由以下兽药的水溶液组成： 特布他林、 甲硝唑、 磺胺二甲嘧啶、 磺胺噻唑、 磺胺吡啶、 磺胺甲基嘧啶、 甲氧苄啶、 依诺沙星、 磺胺异恶唑、 磺胺 嘧啶、 磺胺甲氧嘧啶、 氟洛沙星、 诺氟沙星、 磺胺甲嘧啶、 氧氟沙星、 环丙沙星、 磺胺甲氧基二 嗪、 氯丙肾上腺素、 洛美沙星、 达诺沙星、 恩诺沙星、 奥比沙星、 磺胺甲氧基哒嗪、 托洛布特 罗、 沙拉沙星、 替氟沙星、 磺胺甲噁唑、 司帕沙星、 磺胺多辛、 磺胺莫索、 磺胺苯甲酰胺、 喹酸、 氟羟烯索、 磺胺 二甲氧嘧啶、 磺胺喹喔啉、 萘 氧丙醇胺、 泼尼松、 萘啶酸、 氟霉素、 甲基泼尼松 龙、 隐性孔雀石绿、 曲安奈德、 β ‑苯勃龙、 戊布洛尔、 去甲睾酮、 睾酮、 17 ‑甲基睾酮和醋酸甲 地孕酮。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115469036 A 3