(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211273148.3 (22)申请日 2022.10.18 (71)申请人 中国科学院兰州化学物理研究所 地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水中 路18号 (72)发明人 黄新异　卢聪慧　邸多隆　裴栋　 刘建飞　 (74)专利代理 机构 兰州智和专利代理事务所 (普通合伙) 62201 专利代理师 张英荷 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01)G01N 30/34(2006.01) G01N 30/74(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种基于 冷冻结晶-高效液相色谱法分离检 测橄榄油中色素的方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于 冷冻结晶 ‑高效液相 色谱法分离检测橄榄油中色素的方法， 将橄榄油 与提取溶剂充分混合均匀， 并置于低温条件下冷 冻， 使甘油三脂固化结晶， 经过滤除去固化甘油 三脂， 得滤液； 将滤液蒸发至干， 残余物溶于乙酸 乙酯， 得含类胡萝卜素和叶绿素的样品， 再采用 高效液相色谱 方法实现色素分离和定量检测。 本 发明方法操作简单方便， 无需皂化可从橄榄油中 同时分离得到色素， 且对色素的提取效率分别是 传统固相萃取法和液液萃取法的1.0 ‑1.9倍和 1.0‑2.5倍， 优于传统方法。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 115436530 A 2022.12.06 CN 115436530 A 1.一种基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方法， 其特征在于， 所 述的方法包括如下的步骤： （1） 冷冻结晶提取分离色素： 将橄榄油与提取溶剂充分混合均匀， 并置于低温条件下冷冻， 使甘油三脂 固化结晶， 经 过滤除去固化甘油三脂， 得滤液； 将滤液蒸发至干， 残余物溶于乙酸乙酯， 得含类胡萝卜素 和叶绿素的样品； （2） 高效液相色谱检测： 采用高效液相色谱 对提取得到色素样品进行分离检测， 其条件如下： 色谱柱： ODS ‑BP柱； 柱温： 25℃； 流速： 1.0  mL/min； 流动相组成： 流动相A： 体积比为1:1 的甲醇和乙酸乙酯， 流动相B： 体积比为8:1:1的甲醇、 水和1  M乙酸铵； 洗脱 方式： 梯度洗脱； 检测波长： 45 0 nm、 670nm； 流速： 1.0  mL/min； 进样体积： 20  μL。 2.根据权利要求1所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方 法， 其特征在于， 步骤 （1） 中所述的橄榄油为初榨橄榄油。 3.根据权利要求1所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方 法， 其特征在于， 步骤 （1） 中所述的冷冻温度为 ‑18℃~‑80℃。 4.根据权利要求1所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方 法， 其特征在于， 步骤 （1） 中所述的冷冻时间为 4h~24 h。 5.根据权利要求1所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方 法， 其特征在于， 步骤 （1） 中所述的橄榄油与提取 溶剂的料 液比为1： 10~1： 80。 6.根据权利要求1所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方 法， 其特征在于， 步骤 （1） 中所述的提取溶剂为甲醇、 乙醇和乙酸乙酯中的一种、 两种或者三 种的混合液。 7.根据权利要求1所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方 法， 其特征在于， 步骤 （2） 中所述的检测 波长在450  nm处检测类胡萝卜素、 在670  nm处检测 叶绿素。 8.根据权利要求1所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方 法， 其特征在于， 步骤 （2） 中分离检测的类胡萝卜素包括叶黄素、 cis ‑叶黄素、 cis ‑β‑胡萝卜 素、 β‑胡萝卜素， 叶绿素包括脱镁叶绿素A、 脱镁叶绿素B、 焦脱镁叶绿素A。 9.根据权利要求1或8所述的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的 方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中通过高效液相色谱检测色素的色谱峰面积对色素进行定量， 高效液相色谱对色素样品进行分离检测得到色素的色谱峰面积， 根据色素的浓度与色谱峰 面积之间的线性关系定量得到色素的浓度； 其中， 叶黄素在浓度 为5.0~400 μg/mL范围内， 色素的浓度与色谱峰面积之间 的线性关 系为Y=23753X+7.5787， 线性相关系数R2=0.9995，  X为叶黄素的浓度， 单位 μg/mL， Y为色谱 峰面积； β ‑胡萝卜素在浓度为5.0~400 μg/mL范围内， 色素的浓度与色谱峰面积之间的线性 关系为Y=24294X+26.826， 线性相关系数R2=0.9999，  X为β‑胡萝卜素的浓度， 单位μg/mL， Y 为色谱峰面积； 脱镁叶绿素A在浓度为0.7~70 μg/mL范围内， 色素的浓度与色谱峰面积之间 的线性关系为Y=69652 X+7.8345， 线性相关系数R2=0.9999， 其X为脱镁叶绿素A的浓度， 单位 μg/mL， Y为色谱峰面积。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115436530 A 2一种基于冷冻结 晶‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素 的方法 技术领域 [0001]本发明属于分析化学分离分析技术领域， 涉及一种基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱 法分离检测橄榄油中色素的方法。 背景技术 [0002]橄榄油是由新鲜的油橄榄果实直接经过物理冷榨获得的， 不经过任何化学处理。 在冷榨过程中， 油橄榄果实中的天然脂溶性色素 （类胡萝卜素和叶绿素） 转移至油相， 构成 了橄榄油独特的颜色。 且橄榄油的颜色会在一定程度上影响消费者的选择， 研究发现， 黄绿 色较深的橄榄油更受消费者欢迎。 和其它一般食品一样， 橄榄油的不良加工或不适宜的储 存条件会导致其 天然色素的变质或破坏。 因此， 橄榄油的颜色与其真实性、 新鲜度和质量指 标密切相关。 [0003]类胡萝卜素和叶绿素是重要的营养物质和天然脂溶性抗氧化剂。 在橄榄油储存期 间， 类胡萝卜素和叶绿素可以作为保护剂， 防止光氧化， 其抗氧化潜力与其在橄榄油中的含 量呈正相关。 此外， 类胡 萝卜素和叶绿素的生物活性对人类健康极为有利。 具有 特定结构的 类胡萝卜素作为维生素A前体， 对于人体健康有极大益处， 如叶黄素和β ‑胡萝卜素， 可以改 善认知功能和心血管健康， 防止老年性黄斑变性和白内障的形成。 而叶绿素和一系列叶绿 素衍生物在预防退行性疾病方面显示出巨大 的潜力， 主要表现在抗氧化和抗突变活性， 调 节生物酶活性， 以及诱 导癌细胞系的凋亡等方面。 [0004]橄榄油的高脂含量是影响从其中提取分离类胡萝卜素和叶绿素等脂溶性成分的 主要原因， 除去甘油三脂对分析检测橄榄油中的脂溶性成分至关重要。 固相萃取法和液液 萃取法是目前同时从榨橄榄油中提取分离类胡萝卜素和叶绿素的常用方法。 但这两种方法 均需进行皂化实验以除去脂质获得β ‑胡萝卜素， 操作较为繁琐且皂化过程易造成色素的损 失。 为了简化从橄榄油中分离检测色素的过程， 本文开 发了一种基于冷冻结晶 ‑高效液相色 谱法分离检测橄榄油中色素的方法。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测 橄榄油中色素 的方法； 本发明可以同时从橄榄油中得到类胡萝卜素和叶绿素， 避免了皂化 过程， 且整体色素提取率高。 [0006]本发明提供的基于冷冻结晶 ‑高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方法， 包 括如下的步骤： （1） 冷冻结晶提取分离色素 将橄榄油与提取溶剂按照料液比1： 10~1： 80充分混合， 提取溶剂为由甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯中的一种 、 两种或者 三种的混合溶剂； 将样品置于 ‑18℃~‑80℃环境中， 冷冻4h~24 h， 使橄榄油中的甘油三酯完全固化说　明　书 1/6 页 3 CN 115436530 A 3