ICS 65.020.30 B 43 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5145—2019 鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚 胺残留检测方法 酶联免疫吸附法 2019 - 12 - 27 发布 河北省市场监督管理局 2020 - 01 - 28 实施 发 布 DB13/T 5145—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农业农村厅提出。 本标准起草单位：河北省兽药监察所、河北英茂生物科技有限公司、北京维德维康生物技术有限 公司、秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心、承德市畜禽水产品质量检验监测中心、石家庄市畜产 品质量监测中心、唐山市食品药品综合检验检测中心、邢台市动物卫生监督所、邢台市农业农村局、 邢台市畜牧站。 本标准主要起草人：王萍、刘怡菲、翟明成、李研东、闫超、李海龙、马立才、张嘉楠、刘力、 李云、崔沙沙、赵芳、武侠均、钱春彩、左佳、 孟令庄、李文香、李肖莉、陈宝明。 I DB13/T 5145—2019 鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺残留检测方法 酶联 免疫吸附法 1 范围 本标准规定了鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺残留量酶联免疫吸附（ELISA）法的制 样和检测方法。 本标准适用于鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺残留量的快速筛选测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注的日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 制样 3.1 样品的制备 取新鲜或冷冻的空白或供试组织，去除脂肪和筋膜，绞碎均质。 3.2 样品的保存 -20 ℃以下贮存，保存期6个月。 4 测定方法 4.1 原理 本方法的测定原理是竞争性酶联免疫反应。酶标板微孔上预包被有偶联抗原，加标准品或待测样 品后，再加抗金刚烷胺抗体，包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，通过洗涤除去游离的抗 原、抗体及抗原抗体结合物。再加入酶标记物，酶标记物与抗体结合。加入底物液后，结合到板上的 酶标记物使底物显色。加终止液，用酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，金刚烷胺浓度与吸光度值成负 相关，按绘制的校正曲线定量计算。 4.2 试剂和材料 以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯，水为符合 GB/T 6682规定的二级水。 a) 乙腈； b) 正己烷； c) 金刚烷胺类药物试剂盒，组成见附录 B； 1 DB13/T 5145—2019 d) e) 样品稀释工作液：用水将浓缩样品稀释液（附录 B.7）按 1：19 体积比进行稀释，混匀后备 用； 洗涤工作液：用水将浓缩洗涤液（附录 B.8）按 1：19 体积比进行稀释，混匀后备用。 4.3 仪器和设备 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) 4.4 分析天平：感量 0.01 g； 旋涡振荡器； 离心机：转速 4000 rpm 以上； 氮气吹干仪； 酶标仪（配备 450 nm、630 nm 滤光片）； 单道微量移液器：20μ L～200 μ L，100μ L～1000 μ L 和 1 mL～5 mL； 多通道微量移液器：50μ L～300 μ L； 恒温箱； 计时器：精确到秒； 离心管：15 mL 、50 mL。 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： ——取制备后的供试样品，作为供试试料； ——取制备后的空白样品，作为空白试料； ——取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。 4.4.2 试样提取、净化 准确称取试样3 g±0.05 g于50 mL离心管中，加入50 μ L样品提取剂、6.0 mL乙腈，充分涡动2 min； 室温（25 ℃±5 ℃）下4000 rpm离心5 min；取3.0 mL上清液于15 mL干净离心管中；60 ℃～70 ℃水浴 氮气吹干；加入2 mL正己烷充分涡动30 s，再加入1.0 mL样品稀释液，充分涡动30 s；4000 rpm离心5 min；弃去上层正己烷及中间层杂质；取50 μ L进行检测。 4.4.3 试样测定 4.4.3.1 测定条件 所有操作应在25℃±5℃条件下进行，金刚烷胺检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至相应温度 后方可使用。 4.4.3.2 测定步骤 将50 μ L各标准品工作液/样品溶液分别加入对应的孔中；每孔中加入50 μ L酶标记物工作液和50 μ L抗体工作液，振荡酶标板10 s充分混匀，室温（25℃±2℃）下避光反应30 min，倒掉板孔中液体， 每孔加 260μ L 洗涤工作液充分洗涤4次，每次浸泡15 s～30 s，倒掉板孔中液体，将酶标板拍干；立 即在每孔中加入100 μ L 底物A、B 混合液（底物A液、底物B液按体积1:1混合），振荡酶标板10 s充分 混匀，室温（25 ℃±2 ℃）下避光反应15 min～20 min；在每孔中加入50 μ L终止液，振荡酶标板10 s 充分混匀；终止后5 min内用酶标仪在双波长450 nm、630 nm 下读取酶标板吸光度值。 2 DB13/T 5145—2019 4.4.3.3 平行试验 按4.4.3.2步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 4.5 结果判定和表述 用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式（1）： 相对吸光度值(%)＝ B B0 ×100％………………………………………（1） 式中： B --为标准（试样）溶液的吸光度值； B0 --空白（浓度为0标准溶液）溶液的吸光度值。 将计算的相对吸光度值（%）对金刚烷胺标准品浓度（µg/L）作半对数坐标系统曲线图，对应的 试样浓度可从校正曲线算出。 5 检出限、准确度、精密度 5.1 检出限 本方法的检出限为 0.85 μ g/kg。 本方法的定量限为 1.0 μ g/kg。 5.2 准确度 本方法在1.0 μ g/kg、2.0 μ g/kg添加浓度水平上的回收率为60 %～120 %。 5.3 精密度 本方法在1.0 μ g/kg、2.0 μ g/kg添加浓度水平上的批内、批间变异系数均＜15 %。 5.4 交叉反应率 a) b) c) d) 金刚烷胺：100 %； 金刚乙胺：230.0 %； 索金刚胺：240.0 %； 美金刚胺：＜1.0 %。 6 确证试验 当样品检测结果判为阳性时，应采用国家标准方法进行确证。 3 DB13/T 5145—2019 附 录 A （资料性附录） 标准曲线参考图 图A.1 标准曲线参考图 4 DB13/T 5145—2019 附 录 B （资料性附录） 金刚烷胺系列标准溶液 B.1 金刚烷胺系列标准溶液：0 μ g/L、0.1 μ g/L、0.3 μ g/L、0.9 μ g/L、2.7 μ g/L、8.1 μ g/L。 B.2 高浓度标准品：100 μ g/L。 B.3 酶标板：包被有金刚烷胺偶联抗原。 B.4 金刚烷胺抗体工作液。 无水 Na2HPO4 1.072 g NaH2PO4•2H2O 0.59 g NaCl 8.5 g KCl 0.4 g Proclin 300 200 μ L B.5 金刚烷胺酶标记物工作液。 无水 Na2HPO4 1.072 g NaH2PO4•2H2O 0.6 g NaCl 16 g KCl 0.4 g Proclin 300 200 μ L 牛血清蛋白 50 g 注 1：去离子水定容至 1L。 注 2：配制酶稀释液前-20℃保存的小牛血清要预先解冻，用前慢慢摇匀，且最后加入。 B.6 样品提取剂：0.1 mol/L 硫酸。 B.7 浓缩样品稀释液：20 倍浓缩液。 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4•12H2O 3.58 g KH2PO4 0.24 g 注：去离子水定容至 1L。 5 DB13/T 5145—2019 B.8 浓缩洗涤液：20 倍浓缩液。 NaCl 64 g KCl 0.036 g Na2HPO4 •12H2O 23.2 g KH2PO4 2 g Tween-20 20 mL Proclin 300 300 μ L 注：去离子水定容至 1L B.9 底物 A 液：过氧化氢脲。 内 容 理论量 过氧化氢脲 1g 稳定剂 12.5 g 蒸馏水 1000 mL B.10 底物 B 液：四甲基联苯胺。 内 容 理论量 四甲基联苯胺（TMB） 0.55 g 稳定剂 7.5 g 蒸馏水 1000 mL B.11 终止液：1 mol/L 硫酸。 6