ICS 13.060 Z 16 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 3787—2019 水质 粪大肠菌群测定 光度法 Water quality—determination of fecal coliforms—photometric method 2019 - 12 - 24 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 01 - 24 实施 发 布 DB37/T 3787—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 分光光度法 ........................................................................ 1 5 荧光法 ............................................................................ 4 I DB37/T 3787—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省生态环境厅提出并组织实施。 本标准由山东省环保标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省生态环境监测中心、青岛佳明测控科技股份有限公司、北京华夏科创仪器 股份有限公司。 本标准主要起草人：李恒庆、由希华、宗雪梅、王婷、王聪、郑琳琳、邹康、潘光、周成、张芳、 张爱芳。 II DB37/T 3787—2019 水质 粪大肠菌群测定 光度法 1 范围 本标准规定了测定水中粪大肠菌群的分光光度法和荧光法。 本标准适用于地表水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的应急现场快速测定。 9 本方法的检出限为30 MPN/L，检测范围：30～10 MPN/L，检测周期不大于18 h。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ 494 水质 采样技术指导 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 粪大肠菌群 fecal coliforms 44.5 ℃培养能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 3.2 最大可能数 most probable number，MPN 最大可能数（most probable number，缩写为MPN），又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的 间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表 估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。 4 分光光度法 4.1 方法原理 一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于44.5 ℃环境下，粪大肠菌群产生β-半乳糖苷酶（β -D-galactosidase），并分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，通过连续分光光度（波长： 300 nm～600 nm）测定，依据待测水样色度变化与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，得出粪大肠菌 群浓度。 4.2 干扰和消除 1 DB37/T 3787—2019 4.2.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1）时 加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4）消除干扰。 4.2.2 重金属离子具有细胞毒性， 能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1） 时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（4.3.5）消除干扰。 4.3 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。 4.3.1 粪大肠菌群检测试剂主要成分： ——蛋白胨：5 g； ——硫酸锰：0.005 g； ——硫酸镁：0.001 g； ——硫酸锌：0.001 g； ——磷酸盐：1.78 g； ——两性霉素 B：0.60 g； ——蒸馏水 1 000 mL。 制法：上述试剂溶于蒸馏水中，充分混匀，调整pH值为7.2～7.4，68.95 kPa(115 ℃)，高压灭菌 20 min，分装贮存于4 ℃避光备用。 注：也可采用市售商品化培养基制品。 4.3.2 硫代硫酸钠（Na2S2O3•5H2O）。 4.3.3 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2•2H2O）。 4.3.4 硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10 g/mL，称取 15.7 g 硫代硫酸钠（4.3.2），溶于适量水 中，定容至 100 mL，临用现配。 4.3.5 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：ρ（C10H14N2O8Na2•2H2O）=0.15 g/mL，称取 15 g 乙二胺四 乙酸二钠（4.3.3），溶于适量水中，定容至 100 mL，此溶液保质期为 30 d。 4.3.6 无菌水：取适量纯水，经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，备用。 4.4 仪器和设备 4.4.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 mL、250 mL、500 mL 广口玻璃瓶。 注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。 4.4.2 微生物快速检测仪： ——恒温培养单元：不少于 2 个温控系统，温度控制精度 1 ℃，可自动调节待检测样本培养温度 （44.5 ℃±1 ℃）； ——检测单元：不少于 4 个独立的检测系统，可实现多个样本的同时监测； ——数据显示、处理单元：自动输出检测结果，可查询和显示历史数据。 4.4.3 高压蒸汽灭菌器：121 ℃可调、101.3 kpa。 4.4.4 量筒：50 mL、100 mL。 4.4.5 移液管：1 mL、10 mL。 4.4.6 天平：感量 0.01 g。 注：移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前应按无菌操作要求包扎，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，烘干，备 用。 4.5 样品 4.5.1 样品采集 2 DB37/T 3787—2019 点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ 494和HJ/T 91的相关规定执行。 与其它项目一同采样时，先单独采集微生物样品，采样瓶（4.4.1）不得用水样洗涤，采集水样于 灭菌的采样瓶中。 采集河流、湖库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面10 cm～15 cm 处，瓶口朝水流方向，拔玻璃塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流， 可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。 采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过后专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，避免不同层次的搅扰。 如果采集的是含有活性氯的样品时，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4），以除去活 性氯对细菌的抑制作用(每125 mL容积加入0.1 mL的硫代硫酸钠溶液)；如果采集的是重金属离子含量较 高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（4.3.5），以消除干扰（每125 mL容积加入0.3 mL的乙二胺四乙酸二钠溶液）。 注：15.7 mg硫代硫酸钠(4.3.2)可去除样品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。 4.5.2 样品保存 采样后应在2 h内检测，否则，应10 ℃以下冷藏但不得超过6 h。实验室接样后，不能立即开展检 测的，将样品于4 ℃以下冷藏并在2 h内检测。 4.6 分析步聚 4.6.1 接种 接种待测水样于装有5 mL培养基的检测瓶中，定容至20 mL，水样与培养基应充分混匀。 4.6.2 培养 打开仪器电源开关，待仪器稳定30 min后，将接种后的检测瓶放置于微生物快速检测仪中，按照仪 器说明书进行操作，设置检测温度为44.5 ℃，点击“检测”按钮，2～18小时，仪器自动培养得出结果。 4.6.3 对照试验 4.6.3.1 空白对照 采用无菌水（4.3.6）作为待测水样按照本标准4.6.1～4.6.2进行空白测定，测试结果不得检出， 否则该次样品测定结果无效，应重新测定空白以及待测样品。 4.6.3.2 阴性及阳性对照 粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表1。 表1 阴性、阳性菌株参照表 检测指标 粪大肠菌群 阳性菌种 阴性菌种 大肠埃希氏菌（耐热型） 、克雷伯氏菌属 产气肠杆菌、粪链球菌 (Klebsiella trevisan)（耐热型） (Streptococcus faecalis)、假单胞菌属 将标准菌株制成300～3 000个/mL的菌悬液，将菌悬液按接种（4.6.1）和培养（4.6.2）要求操作， 阳性菌株应呈现阳性反应；阴性菌株呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应重新测定。 注：可先制备较高浓度菌悬液，采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定，再根据实际情况用无菌水 (4.3.6)稀释至300 MPN/mL～3 000 MPN/mL。 3 DB37/T 3787—2019 4.7 结果计算与表示 微生物快速检测仪自动计算检测结果，结果以科学计数方法表示。 4.8 精密度和准确度 微生物检测数据为偏态分布，按其统计分析要求，其检测所得结果全部经对数（以10为底）转换后 进行以下分析。 4.8.1 精密度 6家实验室对粪大肠菌群有证标准样品（7 620 MPN/L）进行测定： 实验室内相对标准偏差为1.92 %～4.77 %，实验室间相对标准偏差为3.98 %，重复性限为0.32，再 现性限为0.52。 7 5 3 6家实验室对3个不同浓度实际样品（浓度为10 MPN/L、10 MPN/L、10 MPN/L）进行测定： 实验室内的相对标准偏差范围分别为：0.64 %～2.36 %、1.07 %～3.06 %、2.42 %～6.81 %，实验 室间的相对标准偏差分别为：0